長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC01296與肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究

戴月梅，王星圓，加孜那·托哈依

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院昌吉分院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆昌吉 831100，2新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊 830017，3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心，烏魯木齊 830054)

近年來(lái)原發(fā)性肺癌已經(jīng)成為全球發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一,中國(guó)國(guó)家癌癥中心2019年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第1位，肺癌死亡率也位于惡性腫瘤第1位[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)約占有所有肺癌的85%，是最常見(jiàn)的肺癌類型[2]。因肺癌早期無(wú)明顯癥狀，且腫瘤自身惡性程度高、侵襲強(qiáng)，大部分患者確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)。雖然靶向、免疫治療近年來(lái)發(fā)展迅速，肺癌的治療有所改善，但隨著靶向治療耐藥的出現(xiàn)和免疫治療相關(guān)的限制，故醫(yī)學(xué)上并未真正改變肺癌患者的預(yù)后和總生存率。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA , LncRNA)，是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以作為腫瘤抑制劑或癌基因發(fā)揮作用[3]，其通過(guò)多種機(jī)制途徑調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因的表達(dá)水平。LINC01296定位于14號(hào)染色體，作為NSCLC的分子生物信號(hào)日益受到重視。國(guó)內(nèi)外研究，早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌中LINC01296的異常表達(dá)[4-6]，之后在乳腺癌、膀胱癌和肺癌中亦發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平顯著升高[7-9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的過(guò)程。在肺癌研究中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[10]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲，腫瘤干細(xì)胞活化和藥物的耐藥問(wèn)題[11]。迄今為止，關(guān)于LINC01296是否參與肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚屬少見(jiàn)。本研究探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC01296與臨床肺癌患者病理類型和預(yù)后關(guān)系，以及與肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)關(guān)系，以期為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移找到新的機(jī)制提供思路。

1 資料與方法

1.1一般資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科2019年10月—2021年2月收治的40例肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織(距離腫塊邊緣>2 cm)，年齡44～82歲，平均年齡(56±14)歲，病理類型腺癌31例，鱗癌6例，小細(xì)胞肺癌3例。按第七版國(guó)際分期TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腺癌進(jìn)行分期，Ⅰ-ⅢA期24例，ⅢB-Ⅳ期7例。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑T100梯度PCR儀(伯樂(lè)儀器有限公司)，單道移液器微量移液器(賽多利斯儀器有限公司)，BE-3100微量振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，H2050R高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，WD-9413B凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)，Q2000B熒光定量PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，DYPC-31DC瓊脂糖水平電泳儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，DM4000光學(xué)顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)集團(tuán))，lnRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR202)，lnRcute lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(北京天根生化科技有限公，F(xiàn)P402)，SYBRGreen PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，AQ601-01)，E-cadherin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-10009R)，Vimentin(Elabscience，E-AB-63601)，MMP-9(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-4593R)，兔二步法試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司，PV-6001)。

1.3方法

1.3.1 組織標(biāo)本的制備 收集新鮮的肺癌組織及癌旁組織(距離腫塊邊緣>2cm)40對(duì)，由于臨床某些組織標(biāo)本較小，故檢測(cè)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因的癌旁組織37例，肺癌組織35例。組織離體后迅速液氮冷凍，部分組織放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２糠纸M織用10%中性福爾馬林固定，流水沖洗固定液，將組織塊梯度酒精脫水。脫水的組織浸入二甲苯中透明。組織透明后放入熔化的石蠟內(nèi)浸漬，冷卻凝固后將組織包裹在其中，修整蠟塊，制成4μm厚度連續(xù)切片，將蠟片牢附于載玻片上放入36℃溫箱中干燥后備用。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)方法 從液氮中取出組織，低溫充分勻漿，加入Trizol試劑提取樣本總RNA，用核酸定量?jī)x測(cè)定RNA的純度和濃度后，采用lnRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物序列如下表1所示，熒光定量體系如下表2所示。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)各組LINC01296、E-cadherin、Vimentin和MMP-9的基因表達(dá)水平，采用2-△△CT法分析目的基因在各測(cè)定組間的表達(dá)差異，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

表2 熒光定量體系

1.3.3 免疫組化檢測(cè) 采用鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)：將石蠟切片65℃烘烤45 min，置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫水，并在枸櫞酸緩沖液(pH 6.4)微波爐高溫修復(fù)。用過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用山羊血清阻斷非特異性反應(yīng)。滴加一抗 E-cadherin、Vimentin、MMP-9，4℃過(guò)夜，然后添加用生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min。用二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下拍片。每張切片選取3個(gè)不同的視野在倒置顯微鏡放大倍數(shù)200倍下觀察拍照。免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核顯示棕色黃染顆粒。采用ImageProPlus 6.0(Media Cybernetics)軟件計(jì)算各組切片累積光密度值(IOD)，所計(jì)算出的累積光密度值表示E-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1LINC01296在肺癌組織和癌旁組織的比較與肺癌患者癌旁組織中的LINC01296相對(duì)表達(dá)量(4.108±0.904)比較，肺癌組織中LINC01296相對(duì)表達(dá)量(81.675±10.152)增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2LINC01296在不同類型不同分期肺癌患者表達(dá)水平的比較觀察40例肺癌患者癌組織中LINC01296表達(dá)與臨床病理類型和TNM分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LINC01296在腺癌組表達(dá)最高，鱗癌次之，小細(xì)胞肺癌最低，三組LINC01296相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腺癌患者Ⅰ-ⅢA期組和ⅢB-Ⅳ期組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同病理類型肺癌組織中LINC01296的表達(dá)水平比較

2.3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)mRNA表達(dá)水平的比較與癌旁組織比較，肺癌組織中Vimentin、MMP-9的mRNA表達(dá)水平高，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子在兩組中的mRNA表達(dá)情況

2.4上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子蛋白表達(dá)水平的比較E-cadherin主要在細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈棕黃色，Vimentin主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，見(jiàn)圖1。與癌旁組織比較，肺癌組織中Vimentin蛋白表達(dá)高，E-cadherin蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子在兩組間的蛋白表達(dá)情況

2.5LINC01296與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的相關(guān)性在肺癌組織中LINC01296的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.798，P<0.01)，與Vimentin、MMP-9的mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.815、0.895，P<0.01)。在肺癌組織中LINC01296的表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721，P<0.01)，與Vimentin、MMP-9的蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.653、0.653，P< 0.05)，見(jiàn)表6。

表6 LINC01296與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)，LincRNA在全身各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。LINC01296的高表達(dá)與腫瘤高侵襲轉(zhuǎn)移及治療抵抗和高死亡率密切相關(guān)[12]。目前亦有報(bào)道LINC01296在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平顯著增高，促癌作用參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，是預(yù)后不良的生物標(biāo)志物[13-14]。因此，研究并探討肺癌有關(guān)生物學(xué)分子指標(biāo)的作用對(duì)癌癥的診斷和治療具有重要臨床意義。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者LINC01296表達(dá)在肺癌組織中明顯升高，提示LINC01296可能是一種預(yù)后生物標(biāo)志物。不同病理類型LINC01296表達(dá)在肺腺癌患者最高，而在鱗癌和小細(xì)胞肺癌表達(dá)相對(duì)較低，三組間有顯著差異，與代靈靈的研究結(jié)果相似[15]，表明LINC01296的表達(dá)與患者肺癌臨床病理類型有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)LINC01296的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[16]，隨著腫瘤疾病的進(jìn)展，晚期患者表達(dá)水平更高，然而本課題依據(jù)肺癌TNM分期，發(fā)現(xiàn)Ⅰ-ⅢA期和ⅢB-Ⅳ期兩組患者LINC01296表達(dá)水平無(wú)顯著增差異。第一、可能與ⅢB-Ⅳ期組患者的數(shù)目過(guò)少有關(guān)，導(dǎo)致對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響，后期還需要增加樣本量以明確兩者之間的關(guān)系。第二、可能晚期患者LINC01296表達(dá)受到其他基因的競(jìng)爭(zhēng)性抑制或阻斷，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果稍有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)了腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和腫瘤耐藥[17]。在NSCLC組織中轉(zhuǎn)錄因子過(guò)度表達(dá),分別通過(guò)下調(diào)和上調(diào)E-cadherin、Vimentin和MMP的表達(dá),從而在NSCLC發(fā)生發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮作用[18-19]。本研究檢測(cè)LINC01296在肺癌組織中高表達(dá)之后，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin、Vimentin、MMP-9在肺癌組織及癌旁組織的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示肺癌組織中E-cadherin的mRNA表達(dá)低，Vimentin和MMP-9的mRNA表達(dá)高；肺癌組織中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)變化同PCR檢測(cè)結(jié)果一致。提示LINC01296的高表達(dá)促進(jìn)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而使得E-cadherin下調(diào)，Vimentin上升，代表降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的MMP-9升高，有機(jī)會(huì)向周圍侵襲或者向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。Song[20]和Sun[21]體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一觀點(diǎn)。但是MMP-9蛋白表達(dá)量組間無(wú)顯著差異，考慮可能是由于基因在轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中發(fā)生變化，導(dǎo)致MMP-9蛋白水平表達(dá)量下調(diào)；并且在最后的統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別樣本存在個(gè)體差異，因此在后續(xù)檢測(cè)時(shí)可增加樣本量，從而避免樣本的個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的偏差。

綜上所述，識(shí)別LINC01296并阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，對(duì)降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移非常重要，同時(shí)也可降低進(jìn)展期肺癌患者的腫瘤負(fù)荷，進(jìn)而提高總體生存率和改善預(yù)后。本文只是臨床部分的實(shí)驗(yàn)研究，觀察到LINC01296在肺腺癌患者中高表達(dá)，夏道韞[22]等研究也發(fā)現(xiàn)LINC01296在肺腺癌中高表達(dá)，表明LINC01296參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，揭示了LINC01296有望成為非小細(xì)胞肺癌的治療和預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)LINC01296的高表達(dá)參與調(diào)控了肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，促使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。后期我們將在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過(guò)LINC01296的過(guò)表達(dá)或沉默，探討LINC01296過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響以及其參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄及翻譯水平相關(guān)指標(biāo)的改變。從而完成從臨床到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等多種分子生物學(xué)方法驗(yàn)證LINC01296參與調(diào)控肺癌細(xì)胞的進(jìn)程，為肺癌臨床治療新模式和新手段提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。