全基因組DNA甲基化分析骨關(guān)節(jié)炎中特征性基因和功能信號通路

胥伯勇，阿不都賽米·艾買提，汪 斐，張曉崗，李國慶，曹 力

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，烏魯木齊 830054)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是常見的關(guān)節(jié)疾病之一，是引起人們疼痛、殘疾和死亡的主要原因之一[1]。隨著我國逐步邁入老齡化社會，膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率明顯升高，骨關(guān)節(jié)炎的診斷和治療也將面臨新的挑戰(zhàn)。OA是一種與老齡化、關(guān)節(jié)損傷等諸多因素相關(guān)的慢性關(guān)節(jié)退行性病變。有研究表明，OA最主要的病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的退變[2]。因骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，故OA的治療手段依然有限。因此進(jìn)一步研究OA的特征性分子生物學(xué)機(jī)制對治療方法的擴(kuò)展和發(fā)病機(jī)制的了解至關(guān)重要。近年來，表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)被越來越多得應(yīng)用于疾病機(jī)制的研究中，尤其在OA進(jìn)展及骨贅形成中已取得一定的進(jìn)展[3]。研究表明，多數(shù)OA患者存在遺傳風(fēng)險基因影響或涉及表觀遺傳調(diào)節(jié)因子[4]。DNA啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化水平的高低與OA的發(fā)病相關(guān)，在OA軟骨中DNA啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)的高甲基化與COL9A1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[5]，在髖及膝OA患者軟骨標(biāo)本中可獲得大量差異性甲基化位點(diǎn)[6]。本研究采用全基因組甲基化和mRNA表達(dá)譜分析研究與OA發(fā)病相關(guān)的表觀遺傳特征調(diào)控基因表達(dá)的作用，為其臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1組織樣本與分組收集2018年3月-2019年1月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)節(jié)中心的3例行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者和3例膝關(guān)節(jié)軟骨正常截肢患者軟骨組織標(biāo)本。將全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者分為OA組，截肢者分為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合西安大略大學(xué)及麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)(the Western Ontario and McMaster Universities OA Index，WOMAC)。排除標(biāo)準(zhǔn)：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；其他骨或關(guān)節(jié)疾病；具有術(shù)前6個月內(nèi)激素使用史。兩組患者根據(jù)年齡、性別進(jìn)行匹配，以排除偏倚。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(20220308-061)，所有患者已簽署知情同意書。

1.2全基因組DNA甲基化譜使用人甲基化850K磁珠芯片(Illumina公司，美國)對入組的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本進(jìn)行DNA甲基化分析，覆蓋整個基因組中超過853307個甲基化位點(diǎn)。獲得的原始圖像數(shù)據(jù)由Genome Studio軟件(Illumina公司，美國)處理，使用甲基化分析工具 RnBeads進(jìn)行質(zhì)量控制。通過計算甲基化和非甲基化位點(diǎn)的熒光信號比例，可確定某位點(diǎn)的甲基化水平(β值)，取值范圍為0(無甲基化)～1(完全甲基化)。

1.3差異甲基化分析將探針檢測P>0.05的甲基化數(shù)據(jù)標(biāo)記為缺失值。10個樣本數(shù)據(jù)中缺失超過2個的探針，位于X或Y染色體上的探針及與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)的探針均被過濾，并對其余317033個探針進(jìn)行進(jìn)一步分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)確定兩組中每個胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)(CpG位點(diǎn))平均β值的差異，基于調(diào)整后的P值(P<0.01)選擇差異性甲基化的CpG位點(diǎn)，使用所選差異性甲基分層聚類來表示組間的差異。針對區(qū)水平的甲基化差異，通過用所測區(qū)域的兩個探針比較兩組間甲基化水平的差異。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO富集分析基因功能，通過京都基因及基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)對生物過程、分子功能及細(xì)胞組分等注釋OA相關(guān)信號通路。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理通過分析全基因組甲基化譜和mRNA表達(dá)譜，比較獲得的P<0.05的基因，篩選出常見顯著改變的基因。通過基因序列及DAVID 數(shù)據(jù)庫，查找與OA相關(guān)的基因本體亞層。通過來自單個或多個不同平臺的高級微陣列數(shù)據(jù)分析和可視化工具(InCroMAP)，進(jìn)行DNA甲基化和mRNA表達(dá)譜的整合途徑富集分析。根據(jù)InCroMAP推薦參數(shù)，對每個數(shù)據(jù)集取不同的閾值，DNA甲基化譜的P<0.05，mRNA表達(dá)譜的倍數(shù)變化>1.5，并通過InCroMAP進(jìn)一步計算每個分析途徑的P值。

2 結(jié)果

2.1單基因分析分析發(fā)現(xiàn)1 299個基因在兩組間存在差異甲基化，其中610個高甲基化，540個低甲基化。整合mRNA表達(dá)譜的DNA甲基化檢測出124個顯著改變的基因，其中36個基因?yàn)轱@著高度甲基化及下調(diào)基因，21個基因?yàn)榈图谆吧险{(diào)基因(圖1)。

2.2驗(yàn)證DNA甲基化結(jié)果驗(yàn)證36個顯著高度甲基化和表達(dá)下調(diào)基因，21個低甲基化和表達(dá)上調(diào)基因發(fā)現(xiàn)，與OA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的靶基因?yàn)槿笔春谢?(DLX5)、同源異型盒基因5(HOXA5)、軟骨酸性蛋白1(CRTAC1)和可溶性富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的清道夫受體蛋白(SSC5D)。

2.3GO富集分析進(jìn)一步對其中64個異?；蛭稽c(diǎn)進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，有53個基因有顯著生物過程的GO亞層，11個基因有顯著細(xì)胞組分的GO亞層，如細(xì)胞骨架組織(P=1.47×10-11，F(xiàn)DR=2.47×10-8)；纖維肌動蛋白帽蛋白復(fù)合物(P=9.20×10-10，F(xiàn)DR=1.72×10-6)；骨骼系統(tǒng)發(fā)育過程(P=9.88×10-10，F(xiàn)DR=1.72×10-5)，其余FDR<0.01的基因本體富集分析結(jié)果(圖2)。

2.4KEGG富集分析結(jié)果共獲得20個有意義的生物學(xué)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路(P=6.25×10-4)，Hippo信號通路(P=0.032)等(圖3)。

3 討論

OA是最常的關(guān)節(jié)退行性疾病，影響著人們生活，給患者家庭造成一定的困擾。研究表明，在世界人口總數(shù)中OA發(fā)病率約為4%～13%，僅次于癌癥和心血管疾病，世界衛(wèi)生組織將其列為危害人類身心健康的主要疾病[7]。骨關(guān)節(jié)炎不僅單一的疾病，其在結(jié)構(gòu)上涉及滑膜、關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨等多種組織，在發(fā)生機(jī)制上可能與多種大分子物質(zhì)、基因位點(diǎn)甲基化、多種信號通路的激活等有關(guān)[8]。OA的發(fā)病是多步驟、多環(huán)節(jié)共同作用的產(chǎn)物，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但其具體表觀遺傳調(diào)控機(jī)制尚未明確[9]。近年來,DNA甲基化水平受到了越來越多研究者的關(guān)注。學(xué)者們對OA軟骨全基因組DNA甲基化譜及mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面分析以便深入認(rèn)識其發(fā)生發(fā)展過程中的作用[10]。本研究通過對膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本進(jìn)行全基因組甲基化分析獲得了一組顯著甲基化的CpG基因位點(diǎn)。進(jìn)一步對上述基因位點(diǎn)進(jìn)行基因本體富集分析后，在DNA甲基化水平和mRNA表達(dá)水平上，在OA患者關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)了64個異常基因位點(diǎn)和2條相關(guān)的生物學(xué)通路。在1 299個顯著甲基化的基因位點(diǎn)中53個明顯影響基因表達(dá)水平的生物學(xué)過程，如DLX5、HOXA5、CRTAC1和SSC5D等。DLX5作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一，可通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導(dǎo)Runx2的表達(dá)和成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展起一定調(diào)控作用[11]。HOXA5對許多器官及組織的發(fā)育至關(guān)重要。有研究表明，HOXA5可通過調(diào)節(jié)CD24和E-鈣黏蛋白來阻礙乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[12]。本研究發(fā)現(xiàn)參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育和絲裂原活化蛋白激酶通路的激活等各種生物功能的相關(guān)通路。這與He等[13]研究成果相一致。本研究對基因甲基化分析結(jié)果提示DNA甲基化的表觀遺傳調(diào)控可能是OA相關(guān)信號通路的重要調(diào)控機(jī)制之一。通過綜合通路富集分析后確定了數(shù)條重要的OA功能性信號通路，其中MAPK信號傳導(dǎo)途徑最為重要。有研究表明，抑制p38-MAPK信號通路可抑制OA患者軟骨細(xì)胞的凋亡和促炎因子的基因表達(dá)[14]。說明MAPK信號通路的激活可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞大量表達(dá)促炎因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶及cox-2等酶類，而靶向阻斷MAPK信號通路可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，減少促炎因子的產(chǎn)生，從而防止關(guān)節(jié)軟骨的降解，抑制OA的進(jìn)展。Hippo信號通路在抑制組織再生、干細(xì)胞增殖、腫瘤生長等方面起著重要作[15]。抑制Hippo信號通路可抑制IL-1β刺激的分解代謝相關(guān)基因表達(dá)和軟骨細(xì)胞凋亡、異常軟骨下骨形成[16]。說明Hippo信號通路的激活可能會促進(jìn)OA的進(jìn)展，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，OA的發(fā)生發(fā)展具有基因組層面的DNA甲基化特征，其中DLX5、HOXA5、CRATC1和SSC5D在OA軟骨中異常甲基化的狀態(tài)和表達(dá)的改變，MAPK和Hippo信號通路活性的改變，可能是造成骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，而這或可為骨關(guān)節(jié)炎分子生物學(xué)指標(biāo)靶點(diǎn)的研究提供新的思路。