西伯利亞接骨木樹(shù)皮提取物對(duì)模型大鼠骨折愈合過(guò)程Wnt/β-catenin信號(hào)通路和生長(zhǎng)因子的影響

努爾哈那提·沙依蘭別克，楊 毅，哈力·哈布力汗，馮興超，葉爾扎提·哈加合曼，金格勒

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合外科，烏魯木齊 830054)

西伯利亞接骨木(Sambucus sibirica Nakai)為忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木屬(Sambucuslinn)植物，主要分布于新疆阿爾泰山脈西伯利亞，其藥用歷史悠久，為新疆北部民間促進(jìn)骨折愈合常用藥，具有接骨續(xù)筋、活血止痛、祛風(fēng)活絡(luò)之功效，一直被用作民間治療骨骼和骨關(guān)節(jié)疾病的藥物[1]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是參與骨折修復(fù)的最關(guān)鍵的信號(hào)途徑之一。由于該通路在骨骼組織中主要的三種類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)，如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，因此已證明該信號(hào)通道會(huì)影響骨骼代謝[2]。Urist[3]首先發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)鈣鹽沉積，形成新骨，有助于骨折愈合。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF )首次被發(fā)現(xiàn)于牛的垂體中，并通過(guò)體外培養(yǎng)其星狀細(xì)胞表達(dá)，是目前被發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的因子。VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞增殖與有絲分裂等方面發(fā)揮著顯著的作用，并且其能夠促進(jìn)新生血管生成能力的提高[4]。接骨木雖然是民間促進(jìn)骨折愈合常用藥，但目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)藥理機(jī)制研究較少，限制了接骨木的臨床應(yīng)用[5]。本文建立大鼠股骨骨折模型，研究西伯利亞接骨木樹(shù)皮提取物對(duì)骨折愈合過(guò)程信號(hào)通路和生長(zhǎng)因子的影響，為進(jìn)一步的臨床運(yùn)用和開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試藥QIAamp Fast DNA Stoolmini 試劑盒(德國(guó)Qiagen)、Trizol(Aidlab公司)、HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)(genecopoeia公司)、瓊脂糖凝膠(Gene company)、引物(新疆昆泰銳生物科技有限公司)、GB11252型BMP-2抗體(武漢塞維爾生物科技有限公司)、19003-1-AP型VEGF抗體(武漢三鷹生物科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、蘇木紫-伊紅染色試劑(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)、4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司)、舒泰(法國(guó)維克有限公司)。

1.2儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅公司)、移液槍(Eppendorf)、DNP-9082型電熱恒溫箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、LXJ-2B型低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、電泳儀(美國(guó)BIO-RAD)、高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司)、凝膠成像儀(美國(guó)BIO RAD)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、OLYMPUS CX-3型光學(xué)雙目顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、-80℃冰柜(日本REVCO公司)。

1.3藥材西伯利亞接骨木樹(shù)皮于2021年8月采集于新疆阿爾泰山脈，重量約8 kg，且已經(jīng)獲得當(dāng)?shù)丨h(huán)保局的許可，采集到原材料后，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥理教研室新華·那比教授鑒定為忍冬科西伯利亞接骨木樹(shù)皮。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠60只，體重240～280 g，來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(新)2018-0003。獲得實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物后，將其存放于25℃～27℃、50%～85%濕度的環(huán)境中生存。本次實(shí)驗(yàn)所有步驟均按照國(guó)家相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并通過(guò)本校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-20200318-22)。

1.5方法

1.5.1 接骨木樹(shù)皮提取物的制備

1.5.1.1 水提取法[6]取4 kg樹(shù)皮置入蒸餾水中，浸泡。第二日取出，用電熱套在90℃的溫度下回流提取，3 h后取出，過(guò)濾。加入5倍蒸餾水，再次在90℃溫度下提取2 h。第三次置入蒸餾水內(nèi)浸泡，在90℃溫度下提取2 h，把以上三次操作中得到的過(guò)濾液混合后，置于室溫下冷卻，進(jìn)行抽濾，將得到的樣品濃縮、冷凍、干燥處理后，獲得水提取物630 g。

1.5.1.2 醇提取法[7-8]再取4 kg樹(shù)皮放置到3倍量70%乙醇液內(nèi)，第二日取出，在60℃的溫度下通過(guò)電熱套提取3 h，過(guò)濾；再加入3倍量95%乙醇浸泡，取出后在60℃下提取2 h；第三次加入70%乙醇，浸泡后同樣在60℃下提取1 h，把上述三個(gè)步驟中得到的濾液混合，如上文操作，經(jīng)過(guò)冷卻、抽濾、濃縮、干燥后，得到醇提取物468.34 g。

1.5.2 動(dòng)物模型的建立 根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行股骨造模，嚴(yán)格無(wú)菌操作。首先肌注舒泰(0.02 mL/kg)，麻醉生效后，取左側(cè)俯臥位，右大腿外側(cè)及膝前備皮(圖1a)，取右大腿外側(cè)縱向切口(圖1b)，切開(kāi)皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，完全顯露股骨干(圖1c)，用線(xiàn)鋸切斷股骨干，克氏針固定(圖1d)，沖洗傷口，縫皮處理，將多余的克氏針緊貼股骨大轉(zhuǎn)子根部折彎，并剪斷。

1.5.3 動(dòng)物的分組及給藥 SD雄性大鼠60只，年齡均為3個(gè)月。將其分為模型組(蒸餾水，100 mL/kg)、假手術(shù)組(蒸餾水，100 mL/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(中華跌打丸，0.54 g/kg)、醇提組(0.34 g/kg)、水提組(0.34 g/kg)，每組12只。將西伯利亞接骨木用于人體骨折的治療時(shí)，用量比例為55.1 mg/kg[10]，根據(jù)相應(yīng)的換算公式[人體用藥劑量(mg/kg)=大鼠用藥劑量(340 mg/kg)×大鼠Km因素(6/人類(lèi)Km因素等于37)]，計(jì)算大鼠的用藥比例，設(shè)人標(biāo)準(zhǔn)體重為60 kg，根據(jù)該參數(shù)將大鼠的提取物、跌打丸使用量計(jì)算出來(lái)，將提取物粉末按一定比例與蒸餾水混合后，給大鼠灌胃，每天1次用藥，分別在第2、4、6周后，從每組中取出一定數(shù)量的大鼠進(jìn)行取樣檢測(cè)，其中模型組、假手術(shù)組使用蒸餾水作對(duì)比。

1.5.4 取材和制樣 給藥第2、4、6周后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，從大鼠右大腿原切口進(jìn)入，逐層切開(kāi)，顯露股骨，取標(biāo)本冰凍保存于-80℃冰箱，待用于PCR和Western Blot檢測(cè)。將其放入準(zhǔn)備好的4%中性甲醛內(nèi)，待標(biāo)本達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，將其取出，根據(jù)相關(guān)操作標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)始脫水。隨后利用石蠟將標(biāo)本上殘存的二甲苯清除干凈。最后將其置入液體石蠟內(nèi)，冷卻凝固后，包埋。觀察股骨干軸，沿其方向進(jìn)行切片，厚5 μm。隨后將所有切片放置在烤片機(jī)上，設(shè)置溫度60℃。30 min后烤干水分，取出自然冷卻，存放冰箱備用。

1.5.5 Wnt2和β-catenin基因水平檢測(cè) 隨機(jī)選取每組股骨標(biāo)本，把骨折線(xiàn)3 mm內(nèi)的骨痂完整取出，提取出RNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以測(cè)定其中Wnt2、β-catenin基因的mRNA表達(dá)水平。將標(biāo)本置于離心管內(nèi)，提取總RNA，用電泳鑒定RNA無(wú)降解及DNA污染，其濃度及純度通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定。之后，取逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，提取cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以β-catin的表達(dá)量作為內(nèi)參進(jìn)行目的基因表達(dá)定量分析，引物序列如下：Wnt2上游:5′ATCCTGCACCTGCGACTACAG-3′，下游：5′-GGCGACTTCTCGAAGTAGACC-3′；β-catenin上游:5′-AAGTTCTTGGCTATTACGACA-3′,下游：5′-ACAGCACCTTCAGCACTCT-3′，加入250 μg/μL的cDNA模版2 μL，10 μL熒光染料，上下游引物各0.5 mL，每個(gè)反應(yīng)體系20 μL，加入定量PCR儀。之后放入RT-PCR反應(yīng)儀：95℃變性4 min，58℃30 s，72℃2 s檢測(cè)熒光，共34個(gè)循環(huán)。目的基因和β-catin基因表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt法獲得，記錄各組基因表達(dá)水平的變化。

1.5.6 Wnt2、β-catenin、p-GSK3蛋白表達(dá)檢測(cè) PMSF勻漿和RIPA組織裂解液內(nèi)加入1 g骨組織行蛋白定量，放置在沸水中約15 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行SDS凝膠電泳，通過(guò)半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，按要求進(jìn)行封閉，將3 mL封閉液加入到孵育盒格子內(nèi)，室溫下封閉2 h，然后用ECL顯色，曝光，以β-catin作為內(nèi)參，獲得目的條帶后，保存圖片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5.7 免疫組化檢測(cè)BMP-2和VEGF指標(biāo) 按照免疫組化DAB顯色試劑盒說(shuō)明對(duì)標(biāo)本切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性，觀察各組切片染色情況。對(duì)染色效果較為理想的部分從不同的角度下進(jìn)行拍照，照片標(biāo)記、保存。隨后將圖像輸入到Image-Pro Plus 6.0中，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，IOD、Area均表現(xiàn)為陽(yáng)性，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，按MOD=IOD/Area表達(dá)式計(jì)算出MOD值，最終得到的MOD均值即為光密度。

2 結(jié)果

2.1各組Wnt2和β-catenin mRNA的表達(dá)情況給藥第2，4周時(shí)，與模型組比較，醇提組和水提組Wnt2、β-catenin基因的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)。醇提組Wnt2、β-catenin mRNA的表達(dá)水平高于水提組和陽(yáng)性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組Wnt2和β-catenin mRNA的表達(dá)情況

2.2各組Wnt、β-catenin和p-GSK3β的表達(dá)情況給藥第2，4周時(shí)，與模型組比較，醇提組、水提組、陽(yáng)性對(duì)照組Wnt2、β-catenin、p-GSK3β蛋白含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，給予接骨木樹(shù)皮提取物后，Wnt2/β-catenin活性得到了顯著增強(qiáng)，有利于骨折愈合，見(jiàn)表2。

表2 各組Wnt、β-catenin和p-GSK3β的表達(dá)情況

2.3不同時(shí)間各組大鼠骨折端骨組織中BMP-2的表達(dá)情況結(jié)果提示，骨折愈合過(guò)程中，各組骨組織成骨、軟骨、成纖維細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞，染色結(jié)果均為棕黃色。第2周和第4周，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、醇提組、水提組BMP-2含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，醇提組和水提組BMP-2表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)；第6周，與模型組和陽(yáng)性對(duì)照組比較，醇提組，水提組BMP-2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)，見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組大鼠骨折端骨組織中BMP-2表達(dá)的MOD值比較

2.4不同時(shí)間各組大鼠骨折端骨組織中VEGF的表達(dá)情況第2周、4周，與模型組比較，醇提組、水提組、陽(yáng)性對(duì)照組VEGF表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05)；第4周，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，醇提組VEGF表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6周，與模型組比較，醇提組，水提組VEGF表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，醇提組VEGF表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組大鼠骨折端骨組織中VEGF表達(dá)的MOD值比較

3 討論

近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別從不同角度對(duì)接骨木屬植物的化學(xué)成分及藥理活性等方面開(kāi)展了較為廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)接骨木屬植物資源開(kāi)發(fā)潛力巨大。接骨木提取物在骨折治療上取得了顯著的療效，具有療程短、功能恢復(fù)快、療效高、無(wú)毒副作用的特點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，接骨木屬植物具有抗骨質(zhì)疏松、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、促骨愈合、抗氧化和抗艾滋病等活性[11]。該屬植物化學(xué)成分豐富，主要含有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、木脂素類(lèi)、氰苷類(lèi)及揮發(fā)油類(lèi)等。研究發(fā)現(xiàn)[1]，接骨木屬植物是化學(xué)成分活性強(qiáng)、毒性低、成藥性高的化合物，對(duì)于指導(dǎo)新藥研發(fā)具有重要的科學(xué)價(jià)值。

文獻(xiàn)報(bào)道，接骨木化合物 5(異槲皮苷)在 1×10-7～1×10-5mol/L 濃度范圍內(nèi)能提升小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)的增殖、分化和礦化能力，呈濃度依賴(lài)性上調(diào) Runx-2 和 Osterix 兩個(gè)基因的 mRNA 表達(dá)，說(shuō)明異槲皮苷有一定的成骨活性，能促進(jìn)骨形成，這很可能是接骨木治療骨折的主要藥效成分[12-13]。接骨木中的木脂素類(lèi)成分可通過(guò)促進(jìn)膠原合成和無(wú)機(jī)鹽的沉積，提高骨痂質(zhì)量，起到促進(jìn)橈骨骨折模型家兔骨折愈合的作用[14]。Yang等[15]的研究報(bào)道，東北地區(qū)接骨木根皮提取物可通過(guò) BMP-2/Runx2 信號(hào)通路促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合。國(guó)內(nèi)外已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)東北等地區(qū)接骨木有促進(jìn)骨折愈合的作用，但關(guān)于新疆阿爾泰山脈道地藥材西伯利亞接骨木對(duì)骨折的實(shí)驗(yàn)研究目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。

目前的報(bào)道以基礎(chǔ)研究為主，尚缺乏深入和系統(tǒng)的研究和開(kāi)發(fā)利用，如化學(xué)成分和藥效基礎(chǔ)的研究尚不完整，無(wú)法闡明化學(xué)成分和臨床應(yīng)用之間的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆西伯利亞接骨木樹(shù)皮提取物激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如BMP-2、VEGF，促進(jìn)骨痂形成并連接，加快骨折愈合。目前已證實(shí)接骨木有成骨效應(yīng)，下一步將現(xiàn)代天然藥物化學(xué)手段與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，探討西伯利亞接骨木有效部位/成分防治的構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)制及其協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)不足之處為未對(duì)接骨木樹(shù)皮促進(jìn)骨折愈合的有效成分和藥物毒性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要是從Wnt/β-catenin信號(hào)通路方面研究組織成骨修復(fù)效果，沒(méi)有深入其他分子、基因、多種信號(hào)通路等方面研究成骨機(jī)制。因此不能完全證明接骨木樹(shù)皮提取物促進(jìn)骨折愈合方面優(yōu)于其他藥物，還有待于進(jìn)一步深入研究。