亞砷酸鈉對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活力及YAP蛋白表達(dá)的影響

熊昊杰，申晨晨，馬 艷

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830017)

砷是廣泛分布于自然界的類金屬元素，流行病學(xué)調(diào)查、動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)表明，砷具有神經(jīng)毒性。大腦作為砷中毒的靶器官之一，砷可以透過血腦或胎盤屏障在腦組織中蓄積，長(zhǎng)期接觸會(huì)導(dǎo)致慢性砷中毒進(jìn)而增加神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)，由于神經(jīng)細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)較為敏感且不易再生，使得砷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性研究顯得尤為重要[1-4]。目前砷致神經(jīng)發(fā)育毒性的具體機(jī)制尚不明確，多集中在凋亡[5]、氧化應(yīng)激[6]、信號(hào)通路改變[7-8]等方面，而河馬(Hippo)信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)分子的激活和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[9-10]。小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞)是一種處于胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)細(xì)胞，是研究神經(jīng)發(fā)育毒性的常用細(xì)胞模型，因此本研究選用NE-4C細(xì)胞作為受試對(duì)象來探究亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞活力及YAP蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探索砷的神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞，廣州吉妮歐公司)；亞砷酸鈉(iAs3+，分析純，北京化學(xué)試劑三廠)；胎牛血清(美國(guó)Sigma公司)；MEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、谷氨酰胺、PBS緩沖液(美國(guó)HyClone公司)；RIPA裂解液、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶公司)；GAPDH單克隆抗體(北京博奧森公司，bs-2188R，稀釋比1∶1 000)；兔抗小鼠YAP單克隆抗體(美國(guó)CST公司，#14074，稀釋比1∶1 000)、兔抗小鼠P-YAP單克隆抗體(美國(guó)CST公司，#13 008，稀釋比1∶1 000)；二抗Anti-rabbit IgG-HRP(美國(guó)CST公司，#7074，稀釋比1∶40 000)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(日本TAKARA公司)；高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)Protein Simple公司)；三色預(yù)染marker、PCR儀(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 NE-4C細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，隔天換液，用0.5%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。藥物干預(yù)時(shí)間按照參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定干預(yù)時(shí)長(zhǎng)為48 h；實(shí)驗(yàn)分組按照亞砷酸鈉干預(yù)細(xì)胞48 h的IC50=1.608 μmol/L分為0(對(duì)照組)、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L組。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 亞砷酸鈉干預(yù)后，于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并進(jìn)行拍照。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)箱過夜，細(xì)胞貼壁后給予不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)48 h，之后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)YAP、P-YAP蛋白表達(dá) 染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞于冰上裂解30 min后、4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。蛋白變性后取20～30 μg進(jìn)行上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次后進(jìn)行顯影，采用Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)YAP下游靶基因mRNA表達(dá) 染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞利用Trizol法提取細(xì)胞RNA，并測(cè)定樣品的濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Primer-Blast軟件設(shè)計(jì)合成Gapdh(上游：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA、下游：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC)、Gli2(上游：GCTCCACACACCCGCAACAC、下游：CTCAGCATCGTCACTTCGGTCAG)、Tead1(上游：GATGAGCGACTCGGCAGATAAGC、下游：TCCCACACGGCGGATAGATAGC)、Tead2(上游：GCCGTCGCAAGATCATCCTGTC、下游：AATATGGCTGGAGACCTGCTTTCG)的熒光定量PCR引物。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書建立熒光定量PCR反應(yīng)體系。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95℃變性5 s，60℃ 34 s，各個(gè)基因的退火溫度不同(GAPDH60℃、Gli2 63℃、Tead1 63℃、Tead2 63℃)退火1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以GAPDH作為內(nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算并分析各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)0 μmol/L組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形，界限清楚，細(xì)胞密度80%～90%，隨著亞砷酸鈉濃度增加細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，梭形“觸角”開始萎縮，細(xì)胞多以單個(gè)細(xì)胞形態(tài)存在，2.4、3.2 μmol/L組細(xì)胞失去原本的形態(tài)，上清液中漂浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片增加，貼壁能力顯著下降，出現(xiàn)大面積死亡，見圖1。

2.2亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞活力的影響CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞增殖具有抑制作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，與0 μmol/L組比較，除0.4 μmol/L組外，其余各組細(xì)胞活力均下降,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞活力的影響

2.3亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞YAP、P-YAP蛋白表達(dá)的影響Western Blot結(jié)果顯示，P-YAP蛋白表達(dá)水平下調(diào)，YAP蛋白表達(dá)水平上調(diào)。與0 μmol/L組比較，1.6、2.4、3.2 μmol/L組P-YAP蛋白表達(dá)水平下降，1.6、2.4、3.2 μmol/L組YAP蛋白表達(dá)水平升高，1.6、2.4、3.2 μmol/L組P-YAP/YAP相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

表2 亞砷酸鈉對(duì)NE-4C細(xì)胞YAP、P-YAP蛋白表達(dá)的影響

續(xù)表2：

2.4亞砷酸鈉對(duì)YAP下游靶基因mRNA表達(dá)的影響檢測(cè)YAP下游靶基因表達(dá)水平結(jié)果顯示，Gli2、Tead1、Tead2 mRNA表達(dá)水平隨亞砷酸鈉濃度的升高而升高，與0 μmol/L組比較，1.6、2.4、3.2 μmol/L組Gli2 mRNA表達(dá)水平升高，2.4、3.2 μmol/L組Tead1 mRNA表達(dá)水平升高，0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L組Tead2 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 亞砷酸鈉對(duì)YAP下游靶基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

砷是一種公認(rèn)的具有遺傳毒性的環(huán)境污染物，研究表明砷具有神經(jīng)發(fā)育毒性，其可通過胎盤、血腦屏障進(jìn)入腦組織中，對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育、成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的損傷，砷暴露還可引起神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞死亡[11-14]。王念等[3]研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露可引起大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)縮小、細(xì)胞間隙變寬和死細(xì)胞增多等顯著細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)砷可明顯降低PC12細(xì)胞的存活率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NE-4C細(xì)胞對(duì)亞砷酸鈉較為敏感，較低濃度亞砷酸鈉干預(yù)即可對(duì)細(xì)胞造成毒性損傷作用，隨亞砷酸鈉濃度的升高細(xì)胞形態(tài)改變，活力降低，存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

YAP是哺乳動(dòng)物中Hippo信號(hào)通路的主要下游效應(yīng)分子，當(dāng)Hippo信號(hào)通路激活時(shí)，YAP被上游激活轉(zhuǎn)變?yōu)镻-YAP，隨后與14-3-3蛋白結(jié)合而滯留在細(xì)胞質(zhì)中或經(jīng)泛素化后降解，無法發(fā)揮增殖的特性，當(dāng)Hippo信號(hào)通路關(guān)閉或該通路核心成員缺失時(shí)會(huì)促進(jìn)YAP/TAZ入核水平增加，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD等結(jié)合并誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因的表達(dá)[14]。YAP和TAZ的作用主要是在TEAD1-4介導(dǎo)下進(jìn)行，YAP/TAZ不可以與DNA直接結(jié)合，其只能作為TEAD1-4的轉(zhuǎn)錄共激活因子參與調(diào)控[15]，同時(shí)也有研究認(rèn)為YAP和TAZ與其他幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也有關(guān)聯(lián)，諸如膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2[16](Gli2)、TEA結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子 1(Tead1)、TEA結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子 2(Tead2)等基因均可被與YAP/TAZ結(jié)合的TEAD轉(zhuǎn)錄激活。

本研究前期結(jié)果顯示雖然砷可上調(diào)Hippo信號(hào)通路的多個(gè)成分，包括SAV1、MOB1、P-LATS1，進(jìn)而激活Hippo信號(hào)通路，然而在NE-4C細(xì)胞中該通路的激活不同于傳統(tǒng)Hippo信號(hào)通路，本研究中Hippo信號(hào)通路的激活并沒有抑制YAP的表達(dá)。YAP蛋白表達(dá)變化呈升高趨勢(shì)，P-YAP蛋白表達(dá)則明顯降低，基于磷酸化蛋白的特殊性，本研究對(duì)各組P-YAP/YAP的比值進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，提示P-YAP在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)下降，進(jìn)而導(dǎo)致YAP入核水平增加，并上調(diào)下游的靶基因Gli2、Tead1、Tead2 mRNA的表達(dá)水平。Li等[17]對(duì)小鼠Hippo信號(hào)通路核心分子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉上調(diào)了Hippo信號(hào)通路中的多個(gè)蛋白的表達(dá)水平，而P-YAP的表達(dá)水平下降，考慮其原因是砷可能會(huì)誘導(dǎo)一種PP2A磷酸酶使P-YAP去磷酸化，從而使其從14-3-3蛋白中浸出，而14-3-3蛋白已知有助于P-YAP在細(xì)胞質(zhì)中被降解。最近另一項(xiàng)研究表明[18]，在Hippo信號(hào)通路失活情況下，YAP可作為一種壓力感受器，選擇性地消除受損肝細(xì)胞，即在細(xì)胞應(yīng)激的作用下，將細(xì)胞從增殖轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲觯@與本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，在NE-4C細(xì)胞遭遇一定損傷情況下，YAP自身活化以清除那些受損細(xì)胞，即YAP蛋白表達(dá)水平雖然上調(diào)，但NE-4C細(xì)胞活力隨亞砷酸鈉濃度的增加而降低。此外，YAP蛋白表達(dá)水平增加提示YAP入核水平增加以激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，有研究發(fā)現(xiàn)，MST1/2、SAV1、MOB1A/B、LATS1/2核心分子缺失或YAP的過表達(dá)小鼠模型均表現(xiàn)出TEAD等靶基因表達(dá)水平升高、祖細(xì)胞增殖增加和組織過度生長(zhǎng)的現(xiàn)象。Lu等[19]在人正常肝細(xì)胞(LX-2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，泮托拉唑(PPZ)可通過阻斷YAP表達(dá)來抑制Gli2 mRNA的表達(dá)，以上發(fā)現(xiàn)均支持YAP的激活可調(diào)控Gli2、Tead1、Tead2等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，亞砷酸鈉可能通過其他途徑激活YAP進(jìn)而上調(diào)下游靶基因表達(dá)水平，而又因亞砷酸鈉對(duì)細(xì)胞的毒性損傷作用，使YAP應(yīng)激性地清除受損細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力下降，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。