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    鉤吻不同部位11種生物堿含量的檢測分析

    2022-10-14 11:36:22陳超杰葉美麟覃妮鳳康宸毓羅達(dá)龍
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2022年19期
    關(guān)鍵詞:蔓藤總堿生物堿

    陳超杰 葉美麟 覃妮鳳康宸毓 江 政 黃 蘅 羅達(dá)龍*

    (1梧州學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,廣西梧州 543002;2梧州市食品藥品檢驗(yàn)所,廣西梧州 543002)

    鉤吻(Gelsemium elegans Benth.)是馬錢科胡蔓藤屬多年生常綠藤本植物,廣泛分布在我國的南部至西南地區(qū),又稱為斷腸草、胡蔓草、大茶藥、野葛、過山風(fēng)等。鉤吻雖然是一種劇毒植物,但在民間常通過外用方式治療疥癩、濕疹、跌打損傷及風(fēng)濕等病痛,且使用歷史悠久[1]。生物堿是鉤吻主要活性成分,同時(shí)也是主要毒性物質(zhì)[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),鉤吻生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗風(fēng)濕和抗焦慮等藥理作用[3]。本文分析鉤吻不同部位的生物堿分布,以期為鉤吻的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 試驗(yàn)材料。供試植物為鉤吻植株,包含根、莖、葉和花,采購自廣西壯族自治區(qū)梧州市,采收日期為2019年11月。

    1.1.2 試劑。供試試劑有:鉤吻生物堿對(duì)照品,購買信息詳見表1;甲醇、甲酸、乙腈,均為色譜純,購自美國歐姆尼公司;氨水、鹽酸,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    表1 鉤吻生物堿對(duì)照品

    1.1.3 試驗(yàn)儀器。試驗(yàn)儀器有MCX固相萃取柱(型號(hào) CreoleMCX60mg/3mL,美國歐姆尼公司);0.22 μm有機(jī)濾膜(美國歐姆尼公司);三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1290-QQQ6490,美國安捷倫公司);電子天平(Quintix224-1,德國賽多利斯公司);全自動(dòng)平行濃縮儀(AutoEVA-60,??萍瘓F(tuán)股份有限公司);超純水凈化系統(tǒng)(UVF,英國ELGA PURELAB Classic公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 對(duì)照品溶液制備。精密量取適量的11個(gè)鉤吻生物堿標(biāo)準(zhǔn)品后,分別加入甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為 4、10、20、40、100、200 ng/mL 混合溶液,作為本研究對(duì)照品溶液備用,對(duì)照品溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.2.2 鉤吻總堿溶液制備。鉤吻總堿溶液的制備方法見參考文獻(xiàn)[4]。簡述如下:將干燥的鉤吻根、莖、葉和花粉碎過40目篩,分別稱取3份,每份100.0 g,分別加入95%乙醇1 L、0.8 L和0.6 L進(jìn)行浸泡,加熱回流3次,每次2 h,減壓過濾合并提取液,濃縮至無乙醇味。稀釋至100 mL,并加入H2SO4調(diào)pH值至1,抽濾得到酸水液,用CH2Cl2萃取,取酸水層堿化,CH2Cl2萃取,取水層,加壓濃縮后得到浸膏,減壓干燥得到鉤吻根、莖、葉和花4個(gè)部位的鉤吻總堿。鉤吻總堿用1%鹽酸稀釋至4%,超聲提取30 min后離心(3 000 r/min)5 min,取上清液2.00 mL到已活化的MCX柱進(jìn)行淋洗和洗脫,取洗脫液,用40℃氮吹至干燥,加入含0.1%甲酸的50%甲醇水1.00 mL溶解,0.22 μm有機(jī)濾膜濾過備用。

    1.2.3 色譜條件。本試驗(yàn)采用Thermo Accucore aQ色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm),以甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動(dòng)相,采用梯度洗脫方式,梯度設(shè)置為0~1.5 min(85%A)、1.5~2.0 min(55%A)、2.0~2.5 min(10%A)、2.5~3.5 min(0%A)、3.5~5.5 min(85%A),流速為0.40 mL/min,柱溫為35℃。進(jìn)樣量控制為1 μL。

    1.2.4 質(zhì)譜條件。離子源是ESI源,參數(shù)設(shè)置如下:毛細(xì)管電壓為3 500 V(正離子模式);離子源溫度為150℃;干燥氣流量為15 L/min;霧化氣壓力為25 Psi;鞘氣溫度為350℃;鞘氣(N2)流量為12 L/min。

    1.3 統(tǒng)計(jì)處理

    通過Graph Pad Prism 7.0軟件,采用方差檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 線性關(guān)系結(jié)果分析

    根據(jù)以上色譜條件進(jìn)行檢測分析,以鉤吻生物堿對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、離子掃描模式測得的質(zhì)量數(shù)峰面積為縱坐標(biāo)(y)建立線性回歸方程,經(jīng)計(jì)算分析后,鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻素戊、(Z)-阿枯米定堿、鉤吻素己、鉤吻綠堿、蘭金斷腸草堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丁、N-甲氧基無水老刺木堿二醇和常綠鉤吻堿在一定濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系(表2)。

    表2 11個(gè)鉤吻生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 精密度、重現(xiàn)性和加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

    分別取11種生物堿的對(duì)照品10 ng/mL,按上述儀器條件平行測定6次,計(jì)算它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;取鉤吻總堿溶液,按上述儀器條件平行測定6次,計(jì)算重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;取同一批鉤吻總堿溶液,分別添加濃度為200、1 000 μg/kg的對(duì)照品,按上述儀器條件平行測定6次,計(jì)算回收率。11個(gè)鉤吻生物堿檢測的精密度、重復(fù)性、回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。它們的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~2.6%,表明儀器精密度良好;重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%~3.3%,表明該方法的重復(fù)性好;添加 200 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為93.2%~98.8%,添加1 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為94.4%~97.6%,符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

    表3 11個(gè)鉤吻生物堿檢測的精密度、重復(fù)性和回收率

    2.3 不同部位的鉤吻生物堿含量測定

    對(duì)鉤吻根、莖、葉和花4個(gè)部位的11種鉤吻生物堿含量進(jìn)行檢測,結(jié)果見表4。4個(gè)部位鉤吻生物堿含量從高到低依次是根>葉>花>莖。從根的鉤吻生物堿含量來看,11種生物堿的檢出量從高到低依次為鉤吻素甲>鉤吻素子>鉤吻綠堿>鉤吻素己>胡蔓藤堿?。竞賶A乙>(Z)-阿枯米定堿>鉤吻素戊>N-甲氧基無水老刺木堿二醇>蘭金斷腸草堿>常綠鉤吻堿。

    表4 鉤吻不同部位的11種生物堿含量比較 單位:(mg·g-1)

    3 結(jié)論與討論

    鉤吻4個(gè)部位的生物堿含量從高到低依次為根>葉>花>莖。從根的鉤吻生物堿含量來看,11種生物堿的檢出量從高到低依次為鉤吻素甲>鉤吻素子>鉤吻綠堿>鉤吻素己>胡蔓藤堿?。竞賶A乙>(Z)-阿枯米定堿>鉤吻素戊>N-甲氧基無水老刺木堿二醇>蘭金斷腸草堿>常綠鉤吻堿。說明鉤吻根部是獲取生物堿的最佳提取部位;根部含量較高的生物堿鉤吻素甲、鉤吻素子和鉤吻素己可能是主要的藥理和毒性活性成分。

    本研究使用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法確定11種鉤吻生物堿的含量,方法便捷靈敏、準(zhǔn)確可靠,便于快速掌握鉤吻的活性成分[4-5]。

    鉤吻是世界聞名的劇毒植物,具有良好的藥用前景,生物堿是其主要活性成分。因此,有必要對(duì)鉤吻的主要部位根、莖、葉和花的生物堿含量進(jìn)行檢測,為其合理高效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示,鉤吻根的生物堿含量最高,莖的含量最低,兩者相差約10倍,葉和花的含量也不足根的1/3。在利用鉤吻植物制備生物堿過程中,應(yīng)盡量挑選鉤吻根作為原料,若將該植物的各個(gè)部位混合進(jìn)行制備,將會(huì)降低生物堿的產(chǎn)量。

    在鉤吻根中,含量最多的生物堿成分是鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻綠堿和鉤吻素己。有研究發(fā)現(xiàn),鉤吻素子在中國鉤吻生物堿檢出量中最高,其次是鉤吻素甲[2],而本次研究的結(jié)果則與之存在一定的差異,這可能與鉤吻產(chǎn)地、采摘時(shí)間和提取方法的差異有關(guān)。在這些含量較高的生物堿中,鉤吻素甲、鉤吻素子和鉤吻素己相關(guān)的藥理和毒性研究報(bào)道較多,這3種物質(zhì)在鎮(zhèn)痛和抗焦慮等方面表現(xiàn)較為突出,但鉤吻素己的急性毒性最大[6-7]。綜上所述,推斷出鉤吻素甲和鉤吻素子具有較好的成藥性,而鉤吻素己則可作為研究鉤吻中毒的代表性活性物質(zhì)。

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