穩(wěn)定同位素內標在小麥脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）檢測中的作用

徐長亮，陳相宇，曹天亞，卞 軍，郝國輝

（1.宿遷市農(nóng)畜產(chǎn)品質量檢測中心，江蘇宿遷 223800；2.宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質量檢驗檢測中心，江蘇宿遷 223800； 3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質量檢驗測試中心，江蘇南京 210036）

糧食在種植、收獲、加工、運輸和儲存過程中易被真菌感染而產(chǎn)生真菌毒素，這些真菌毒素隨著糧食及其制品進入食物鏈，最終可能引起人或動物的致癌、致畸等病變。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名嘔吐毒素，對糧食污染最為普遍，且玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇容易動態(tài)積累[1]。人和動物食用嘔吐毒素超標的食物后容易出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃部不適、免疫抑制以及生殖異常等癥狀[2]。因此，檢測糧食中的真菌毒素，能夠保障糧食食用安全。

嘔吐毒素的檢測技術有很多，如薄層色譜法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金免疫層析法[6]、時間分辨熒光免疫法以及化學發(fā)光免疫分析法等。近年來，液相色譜串聯(lián)質譜法因其檢測周期短、靈敏度好、準確度高和重復性優(yōu)異而被廣泛應用在多種真菌毒素檢測中。本文根據(jù)實驗室現(xiàn)有條件，采用《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》 （LS/T 6133—2018）[7]對小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進行檢測，并對同位素內標法和外標法進行定量比對，同時也對該方法中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法檢出限和方法定量限進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準溶液，購自Dr公司；乙腈、甲醇、乙酸銨和乙酸，均為色譜純，購自Merk公司；0.22 μm濾膜，購自天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters TQS 高效液相串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司）；PL602E電子天平（梅特勒-托利多公司）；TG16-WS離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；振蕩器（Talboys公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取

正確稱取5.00 g小麥粉于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸混合液（體積比為70∶29∶1）對樣品進行提取，渦旋振蕩提取30 min，然后離心 10 min（離心速度不低于6 000 r·min-1），吸取0.5 mL 上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL水并渦旋混勻，在4 ℃下離心10 min（離心速度不低于 12 000 r·min-1）），取上清液過0.2 μm聚四氟乙烯 濾膜，收集濾液。一份濾液直接上機測定，一份取180 μL濾液，并加入20 μL穩(wěn)定同位素內標后，渦旋混勻，供液相串聯(lián)質譜儀測定。

1.3.2 標準曲線的繪制

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準溶液逐級稀釋成兩份0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1、0.8 mg·L-1和1.0 mg·L-1系列標準溶液，一份直接上機測定，一份取180 μL標準溶液加入20 μL穩(wěn)定同位素內標后，渦旋混勻，供液相串聯(lián)質譜儀測定。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素內標離子圖

2 結果及分析

2.1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其同位素離子圖

同位素是指原子序數(shù)（質子數(shù)）相同而質量數(shù)（中子數(shù)）不同的元素，可分為穩(wěn)定性同位素和放射性同位素。穩(wěn)定性同位素是天然存在的，目前技術手段檢測不到放射性的一類同位素。與放射性元素示蹤技術相比，穩(wěn)定性同位素技術無輻照傷害、安全、不受半衰期的影響，可適用于長時間的示蹤實驗。同位素內標法，應該是目前最準確的分析方法，因為他們結構一樣，唯一的區(qū)別是H被D（或者是C及其他原子）取代，推測其離子化效率，分離度等幾乎一樣。通過檢測得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素離子圖見圖1，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素內標離子的保留時間基本一致。

2.2 標準曲線

以待測毒素及其對應內標的濃度比為橫坐標，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和內標峰面積比為縱坐標，對各個數(shù)值點進行最小二乘線性擬合，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）同位素內標法擬合曲線，線性方程為Y=172.082X+2 015.03，相關系數(shù)為0.998 2。

以待測毒素濃度比為橫坐標，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）峰面積比為縱坐標，對各個數(shù)值點進行最小二乘線性擬合，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）外標法擬合曲線，線性方程為Y=422.021X- 34 359.1，相關系數(shù)為0.993 0。

2.3 方法檢出限和定量限驗證

按照LS/T 6133—S/T 方法，分別在樣品中加入方法檢出限和定量限濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標準物質，按照提取過程進行處理后得到結果。對添加濃度為45 μg·kg-1的樣品（濃度與方法檢出限一致）檢測，7次測量結果的平均回收率為87%，相對標準偏差為6.4%；對添加濃度為150 μg·kg-1樣品（濃度與方法定量限一致）檢測，7次測量結果的回收率為98%，相對標準偏差為2.8%。

依據(jù)《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417證指南行處）對結果進行相應評定，發(fā)現(xiàn)實驗室具備使用LS/T 6133—2018對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進行檢測的能力。

2.4 小麥標準物質外標校正結果與內標校正結果分析

按照LS/T 6133—2018方法對國家二級標準物質小麥粉（GBW（E）100382）中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進行檢測，并分別使用內標法及外標法擬合曲線進行校正分析，檢測結果如表1所示。

依據(jù)《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》（GB/T 32465—2015）標準，使用有證標準物質對結果正確度進行判定，小麥有證標準物質 （GBW（E）100382）中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）使用穩(wěn)定同位素內標法校正結果與標準值的偏差為0.26，小于一倍標準值偏差（0.30 mg·kg-1），符合偏差要求，結果準確；使用外標法對其進行校正的結果與標準值的偏差為1.37，大于3倍標準值偏差，不符合準確度要求，結果不準確。

表1 小麥標準物質脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）結果分析

3 結論

按照《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》（LS/T 6133—2018）對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行檢測，檢測過程簡便快捷，提取步驟精簡方便，穩(wěn)定同位素內標法得到的檢測結果準確可靠，精密度符合要求，是目前檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和其他真菌毒素比較有優(yōu)勢的檢測方法。但目前市場上穩(wěn)定同位素內標購買價格高昂，期待穩(wěn)定同位素內標商品化后的價格能夠有所降低。