超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的 孔雀石綠含量

黎建樑，王若男，鐘建權(quán)，盧婉婷

（廣東省綠色產(chǎn)品認(rèn)證檢測中心有限公司，廣東廣州 510440）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）是一種三芳基甲烷染料，分子式為C23H25ClN2，通過苯甲醛和二甲基苯胺在濃硫酸或氯化鋅的存在下縮合而成的一種深綠色的結(jié)晶固體[1]。目前，水產(chǎn)品是人們高質(zhì)量蛋白的主要來源之一，是個(gè)快速發(fā)展的食品生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)，水產(chǎn)品的在養(yǎng)殖過程中容易受蠕蟲和一些真菌的感染，影響魚類的存活率[2]。1974年，研究人員發(fā)現(xiàn)孔雀石綠具有控制原生動(dòng)物真菌感染的功能。后來，人們發(fā)現(xiàn)孔雀石綠應(yīng)用在水產(chǎn)品中是一種很好的抗菌劑，能提高水產(chǎn)品的存活率，因此孔雀石綠曾被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)品中[1]。然而，孔雀石綠對人體和環(huán)境均會(huì)造成一定的危害。1983年，邁耶和喬根森等科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠對人體有基因毒性和致癌性。從環(huán)境的角度來說，孔雀石綠作為污染物在生態(tài)環(huán)境中，沒有資料證明微生物等對其具有代謝能力，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠可以在體外抑制人谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶[3]。

國家已經(jīng)明令禁止孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用，在動(dòng)物食品中規(guī)定不能檢出孔雀石綠。孔雀石綠被檢出的事件仍時(shí)有發(fā)生，孔雀石綠進(jìn)入生物體內(nèi)會(huì)迅速代謝成隱色孔雀石綠（Leuco Malachite Green，LMG），并在生物體內(nèi)富集[4]，因此建立孔雀石綠和隱形孔雀石綠檢測方法十分必要。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)中孔雀石綠常用的檢測方法有高效液相法和液相質(zhì)譜法[5]，其中高效液相法定量準(zhǔn)確，對氧化柱和流動(dòng)相的要求較高[6]，液相質(zhì)譜法定性準(zhǔn)確，不需要柱后衍生[7]。本文建立一種孔雀石綠的檢測方法，用乙腈提取，中性氧化鋁柱萃取柱凈化，建立超高效液相色譜質(zhì)譜檢測方法，同位素內(nèi)標(biāo)定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來源：超市購買；孔雀石綠鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（80.0%），佳途科技；隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（96.8%），佳途科技；孔雀石綠鹽酸鹽-D5標(biāo)準(zhǔn)品（97.6%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；隱色孔雀石綠-D6標(biāo)準(zhǔn)品（99.0%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸、乙腈：色譜純，邁瑞達(dá)公司；乙酸銨：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；試驗(yàn)用水：符合《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/ T 6682—2008）中一級(jí)水的規(guī)定。

1.2 儀器與設(shè)備

0.22μm PETF針式過濾器、中性氧化鋁小柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Agilent 1290-6470超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；立式高速冷凍離心機(jī)（HR/T20MM），湖南赫西儀器裝備有限公司；多管渦旋混合器（EFAA-HM-01），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA有限公司，RV 10 Basic V系列；超聲波清洗機(jī)，深圳市鈺潔設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)液配制：稱取13.10 mg 的孔雀石綠鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至 100 mL，混勻，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，配制成100 ng·mL-1的孔雀石綠工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

稱取10.30 mg的隱色孔雀石綠，用乙腈溶解并定容至100 mL，混勻，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述 100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，配制成 100 ng·mL-1的隱色孔雀石綠工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

孔雀石綠內(nèi)標(biāo)和隱色孔雀石綠溶液配制：稱取10.00 mg的孔雀石綠-D5，用乙腈溶解并定容至 100 mL，混勻，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。

稱取10.00 mg隱色孔雀石綠-D6標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL，混勻，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述孔雀石綠內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液和隱色孔雀石綠內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液 100 μL至100 mL容量瓶中，配制成100 ng·mL-1的孔雀石綠及其代謝物工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品制備和前處理方法

取樣品可食用部分用破壁機(jī)打碎，稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入100 μL孔雀石綠及其代謝物內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋1 min，加入10 mL乙腈溶液，振 蕩 提 取5 min，超 聲5 min，以10 000 r·min-1離心5 min，將提取液倒入容量瓶中，在樣品中再加入 10 mL乙腈溶液，振蕩提取5 min，超聲5 min，以10 000 r·min-1離心5 min，合并兩次提取液，定容至25 mL，中性氧化鋁柱先用5 mL乙腈活化，加入 5 mL提取液過柱收集濾液，再加入2 mL乙腈淋洗小柱，合并兩次濾液，50 ℃旋蒸至近干，用1 mL 50%的乙腈水定容，通過0.22 μm PETF濾膜于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別取10 μL、20 μL、30 μL、50 μL、80 μL、100 μL和500 μL孔雀石綠和隱色孔雀石綠工作液于5 mL容量瓶中，分別加入100 μL孔雀石綠及其代謝物內(nèi)標(biāo)工作液，用50%的乙腈水定容5 mL，通過 0.22 μm PETF濾膜于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流 速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A為乙腈-流動(dòng)相B 5 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸，洗脫程序見 表1。

表1 液相色譜洗脫程序

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源類型：ESI電噴霧源；離子化模式：正離子模式；使用的碰撞氣：氮?dú)釴2；毛細(xì)管電壓：4 000 V；離子源溫度：350 ℃；掃描模式：MRM模式（多反應(yīng)離子掃描）。對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的離子對、質(zhì)譜儀設(shè)置參數(shù)見表2。各物質(zhì)的定量離子圖譜，見圖1。

表2 孔雀石綠及其代謝物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2 結(jié)果與分析

化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限如表3所示，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.995可滿足檢測需要，通過目標(biāo)物在空白樣品中的信噪比，計(jì)算出檢出限和定量限，由表3中數(shù)據(jù)可知，結(jié)果可達(dá)到檢測要求。

準(zhǔn)確稱取空白樣品18份，每份5.00 g，共3組，6個(gè)平行，分別定量加入低、中、高（0.3 μg·kg-1、 0.9 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1）共3個(gè)水平的孔雀石綠和隱 色孔雀石綠工作液，測得加標(biāo)回收率71.6%～ 110.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～5.0%。詳見表4。

表3 方法的線性方程、檢出限和定量限

表4 空白樣品加標(biāo)回收率和精密度

圖1 各物質(zhì)的定量離子圖譜

3 結(jié)論

本研究建立了一種HPLC-MS/MS測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的方法。用乙腈直接提取水產(chǎn)品中的孔雀石綠，用中性氧化鋁柱除雜，用同位素內(nèi)標(biāo)法對化合物進(jìn)行定量。結(jié)果表明，本方法回收率高，線性好，精密度高。本方法能快速測定水產(chǎn)品中的孔雀石綠，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求。