高糖培養(yǎng)對大鼠腎小管上皮細(xì)胞中SIRT1和PGC-1α水平及線粒體功能的影響*

劉興梅， 金紅君， 沈燕， 何曉蘭， 田禾

(1.貴州省人民醫(yī)院 檢驗科, 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 貴州 貴陽 550002； 3.貴州省人民醫(yī)院 病理科, 貴州 貴陽 550002； 4.貴州省臨床檢驗中心 檢驗檢測科, 貴州 貴陽 550002)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease, DKD)伴有腎小球硬化、系膜細(xì)胞擴(kuò)張以及腎間質(zhì)纖維化等一系列病理變化，如不及時治療，隨著病程進(jìn)展將發(fā)展為終末期腎病。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與DKD密切相關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制尚未明了[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α，PGC-1α)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，亦是線粒體生物發(fā)生和功能的主要調(diào)節(jié)因子。PGC-1α在高能量需求的組織中高表達(dá)，與糖脂代謝相關(guān)[2]。足細(xì)胞構(gòu)成腎小球濾過屏障的外層，其能量需求依賴于與線粒體動力學(xué)密切相關(guān)的有效氧化呼吸。高糖可降低PGC-1α的表達(dá)，并降低足細(xì)胞中的線粒體DNA含量，從而改變線粒體生物發(fā)生和導(dǎo)致線粒體DNA損傷[3]。沉默配對型信息調(diào)節(jié)因子2同源物1(sirtuin 1，SIRT1)是一種多能分子，在細(xì)胞存活和凋亡、炎癥應(yīng)激以及細(xì)胞生長、分化、代謝等方面發(fā)揮著重要作用，通過改變底物的乙?；癄顟B(tài)來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，參與ATP的生成，從而改善線粒體功能障礙[4]。目前對腎小管上皮細(xì)胞，PGC-1α與SIRT1是否能通過保護(hù)線粒體從而減少高糖所致的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞能量改變的研究甚少，因此，本研究通過體外培養(yǎng)NRK52E細(xì)胞，探討在高糖環(huán)境下SIRT1和PGC-1α對NRK52E細(xì)胞中線粒體損傷及凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

NRK52E細(xì)胞購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)，抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、PGC-1α、SIRT1、cleaved-Caspase-3(proteintech)、 腺嘌呤核苷三磷(adenosine-triphosphate, ATP)含量檢測試劑盒(Solarbio)、線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒及超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(enhanced chemiluminescence, ECL)化學(xué)發(fā)光試劑盒為碧云天產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) NRK52E細(xì)胞株復(fù)蘇：液氮罐中取出細(xì)胞，迅速放入37 ℃水浴箱融化，將細(xì)胞懸液加入含DMEM培養(yǎng)基的離心管，反復(fù)吹打，800 r/min離心5 min，小心吸棄上清，加含10% FBS 低糖DMEM培養(yǎng)基4 mL，重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 將NRK52E細(xì)胞分為正常糖組(NG組，含糖5.5 mmol/L、10% FBS的DMEM培養(yǎng))和高糖組(HG組，含糖30 mmol/L、10% FBS的DMEM培養(yǎng))，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測線粒體ROS水平 按照1 ∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋活性氧熒光探針(DCFH-DA)，使終濃度為10 μmol/L；細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的 DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×1010個/L，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測線 粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm) 收集細(xì)胞用PBS洗滌細(xì)胞3次，收集不多于1×106個細(xì)胞，取10×Incubation Buffer 100 μL加滅菌去離子水900 μL稀釋成1×Incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至37 ℃，吸取1×Incubation Buffer 500 μL，加入JC-1 1 μL旋渦混勻配成JC-1工作液；取JC-1工作液500 μL將細(xì)胞均勻懸浮，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，室溫離心(2 000 r/min, 5 min)收集細(xì)胞，用1×Incubation Buffer 洗2次；吸取10×Incubation Buffer 500 μL重新懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.5紫外分光光度法檢測線粒體ATP 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)、棄上清，比例為細(xì)胞數(shù)量(104個) ∶提取液體積(mL)=(500～1 000) ∶1(建議500萬細(xì)胞加入提取液1 mL)， 超聲波破碎1 min(冰浴，強(qiáng)度 20%或200 W，超聲2 s，停1 s)，12 000 r/min 4 ℃離心10 min；取上清液至另一EP管中，加入氯仿500 μL震蕩混勻，12 000 r/min 4 ℃離心3 min，取上清，置冰上待測。

1.2.6Western blot檢測PGC-1α、SIRT1和cleaved-Caspase-3蛋白水平 從各組細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到膜上，4 ℃下與PGC-1α(proteintech, 1 ∶1 000)、抗SIRT1(proteintech, 1 ∶1 000)、抗cleaved-Caspase-3(proteintech, 1 ∶1 000)以及鼠抗GAPDH蛋白(proteintech, 1 ∶3 000)單克隆抗體孵育過夜；用含有0.1%Tween-20(TBST)的Tris緩沖液重復(fù)洗滌膜，用Tris緩沖液(TBS)洗滌1次，二抗孵育1 h；加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯現(xiàn)免疫染色的蛋白質(zhì)。通過ImageJ軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ROS水平

NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與NG組比較，HG組ROS的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：A為活性氧的表達(dá)水平，B為活性氧表達(dá)水平統(tǒng)計；(1)與NG組比較，P<0.01。圖1 NG、HG組NRK52E細(xì)胞的ROS水平Fig.1 ROS levels of NRK52E cells in NG and HG groups

2.2 ΔΨm表達(dá)

NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與NG組比較，HG組線粒體ΔΨm的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：A為線粒體膜電位，B為線粒體膜電位統(tǒng)計條圖；(1) 與NG組比較，P<0.05。圖2 NG、HG組NRK52E細(xì)胞中ΔΨm Fig.2 ΔΨm levels of NRK52E cells in NG and HG groups

2.3 線粒體ATP水平

NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與NG組比較，HG組線粒體ATP水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

2.4 PGC-1α、SIRT1與cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)

NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與NG組比較，HG組NRK52E細(xì)胞中PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)、SIRT1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。見圖4。

注：(1) 與NG組比較，P<0.01。圖3 NG和HG刺激后NRK52E細(xì)胞中ATP水平Fig.3 ATP levels of NRK52E cells in NG and HG groups

注：與NG組比較，(1) P<0.01, (2) P<0.05。圖4 NG、HG組NRK52E細(xì)胞中PGC-1α、SIRT1與cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.4 The protein expression levels of PGC-1α，SIRT1， and cleaved-Caspase-3 in NRK52E cells in NG and HG groups (Western blot)

3 討論

大量的研究表明，氧化應(yīng)激在DKD的發(fā)生發(fā)展中起著獨立作用[5-6]。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源。在DKD進(jìn)程中，代謝底物的傳遞對于ATP的產(chǎn)生會改變脂肪酸和氧的含量，糖尿病患者為滿足ATP需求而使用的燃料源會導(dǎo)致耗氧量增加，線粒體能量障礙，釋放過多的ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而從線粒體膜釋放細(xì)胞色素酶C，激活caspase-9和caspase-3通路，從而引起細(xì)胞凋亡和線粒體損傷[6-7]。腎臟組織富含線粒體，具有高能量需求，因此線粒體功能失調(diào)可能導(dǎo)致腎固有細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎功能和結(jié)構(gòu)損傷。ROS的產(chǎn)生水平超過了局部抗氧化能力，是糖尿病腎臟線粒體功能障礙的生物標(biāo)志[8]。然而，高糖如何引起線粒體損傷及細(xì)胞凋亡的機(jī)制不完全清楚。

PGC-1α對于維持能量穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。PGC-1α調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生、肝臟糖異生，參與呼吸鏈亞單位，包括β-ATP合酶、細(xì)胞色素C氧化酶(COX)IV和細(xì)胞色素C的調(diào)控[9]。早期研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α過度表達(dá)可減少胰島B細(xì)胞胰島素分泌，而且PGC-1α在B細(xì)胞凋亡、再生、胰島素分泌以及線粒體新陳代謝中發(fā)揮作用[10]。線粒體是一種復(fù)雜的細(xì)胞器，可以調(diào)節(jié)多種生理功能的細(xì)胞過程和功能，包括氧化還原調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡等。在DKD的發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激是一個主要的病理過程，而川芎嗪硝酮可通過調(diào)控PGC-1α的表達(dá)進(jìn)而改善HK-2中線粒體功能，恢復(fù)腎臟功能[11]。一方面高糖環(huán)境刺激足細(xì)胞使線粒體的電子傳遞鏈激活，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，大量ROS產(chǎn)生，線粒體功能障礙，另一方面線粒體在胰島素分泌中起著重要作用。線粒體DNA(mtDNA)突變與糖尿病發(fā)病的病因有關(guān)[12]。本研究結(jié)果也表明，高糖環(huán)境下，NRK52E細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)減少，線粒體膜電位降低，ROS產(chǎn)生增加，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)增加，這些結(jié)果提示，高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激，而PGC-1α具有保護(hù)線粒體的作用，高糖可能通過抑制PGC-1α的表達(dá)引起線粒體功能障礙。

Sirtuins參與抗氧化和氧化應(yīng)激相關(guān)的過程和功能，如線粒體功能、DNA損傷修復(fù)、代謝，并影響細(xì)胞能量和氧化還原平衡。此外，由于sirtuins的脫乙?；钚砸蕾囉贜AD+，即一種氧化還原信號分子，Sirtuins通過調(diào)控控制細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH比率的抗氧化酶和轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[13]。SIRT1表達(dá)降低，通過去乙?；疐OXO3a活性致氧化應(yīng)激損傷。線粒體是人體細(xì)胞的能量庫，并認(rèn)識到其在ATP和NAD+生產(chǎn)中的關(guān)鍵作用。高血糖癥通過電子傳遞鏈增加還原當(dāng)量的穿梭，從而解除對線粒體功能的調(diào)控，并導(dǎo)致顯著升高活性氧生成和ATP輸出減少，增強(qiáng)線粒體ROS的產(chǎn)生，損害線粒體導(dǎo)致功能失調(diào)的線粒體積累，引起細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果觀察到，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)增加。然而，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制不甚清楚。同時也觀察到，高糖影響NRK52E細(xì)胞，導(dǎo)致PGC-1α與SIRT1的表達(dá)降低，ATP的能量供給增加，線粒體膜電位降低，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3增加，結(jié)果表明高糖可能通過抑制PGC-1α表達(dá)，進(jìn)而PGC-1α通過抑制下游的SIRT1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。有研究報道，在心肌原代細(xì)胞中，PGC-1α 可顯著上調(diào) SIRT3 的表達(dá)，并提高 SIRT3 的去乙?；富钚裕琍GC-1α 可能通過上調(diào) SIRT3 發(fā)揮心肌保護(hù)作用[15]。 在高糖處理人腎小管上皮細(xì)胞中，通過PGC-1α下調(diào)可引起足細(xì)胞凋亡[16]?？梢?，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞，PGC-1α可能通過SIRT3介導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。具體的機(jī)制需要體外干預(yù)實驗進(jìn)一步驗證。

在DKD的早期階段，為獲得機(jī)體所需要的能量，ATP適應(yīng)性的增加[17]，而在糖尿病誘導(dǎo)后4周，伴隨著線粒體斷裂，線粒體損傷逐漸增加，腎組織ATP含量卻逐漸減少[18]。高糖環(huán)境，通過氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡致線粒體功能障礙[19]。其中多種信號通過參與其調(diào)控，有研究提到，Akt活化與線粒體功能、氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)，GSK3β是Akt下游的一種蛋白質(zhì)，廣泛參與線粒體功能的調(diào)節(jié)。Akt被磷酸化激活，激活的Akt(p-Akt)可反向調(diào)節(jié)GSK3β。在糖尿病腎病，Akt磷酸化被抑制，GSK-3β被激活。然后，活化的GSK-3β調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的比例，使線粒體通透性增加，刺激線粒體轉(zhuǎn)換孔的開放，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，最終參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)，增加細(xì)胞凋亡[20]。在AKI模型的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過激活PGC-1α調(diào)控SIRT1而抑制氧化應(yīng)激，可見，PGC-1α與SIRT1在AKI氧化應(yīng)激中扮演重要角色[21]。在DKD中，腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調(diào)節(jié)PGC-1α信號的一個重要調(diào)節(jié)器，其磷酸化形式可通過激活下游靶SIRT1而啟動PGC-1α信號級聯(lián)[22]。SIRT1是一種NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，SIRT1具有多種生物學(xué)功能，包括抗衰老、改善糖脂代謝以及胰島素敏感性的調(diào)節(jié)。PGC-1α是SIRT1的底物，即SIRT1脫乙?；疨GC-1α，從而提高PGC-1α轉(zhuǎn)錄活性[23]。

綜上所述，SIRT1和PGC-1α可通過維護(hù)線粒體功能，PGC-1α可能上調(diào) SIRT3 的表達(dá)，通過Akt通路進(jìn)而通過減少高糖引起的NRK52E細(xì)胞凋亡損傷，對NRK52E細(xì)胞具有保護(hù)作用。