Caspase-3和GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響*

諶媛媛， 胡銀逢， 劉金龍

(1.安徽省醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 安徽 合肥 230022； 2.臨泉縣人民醫(yī)院 神經(jīng)外科, 安徽 臨泉 236400)

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的良性腫瘤，通常以切除子宮為治療手段，但是子宮切除不僅會(huì)導(dǎo)致患者的生育能力喪失，而且還有可能誘發(fā)盆底功能障礙性疾病[1-2]。因此，積極探尋子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制并給予相應(yīng)的干預(yù)治療可能是治療子宮肌瘤的良好方式。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞死亡方式，與凋亡和壞死在形成機(jī)制和細(xì)胞形態(tài)學(xué)上存在明顯差異[3]。既往的研究顯示Gasdermin蛋白家族與焦亡密切相關(guān)，其中消皮素E(gasdermin E，GSDME)依賴性細(xì)胞焦亡是腫瘤領(lǐng)域中研究最熱的焦亡發(fā)生機(jī)制。GSDME又稱DFNA5，是一個(gè)耳聾相關(guān)基因，由GSDME-C端和GSDME-N端結(jié)構(gòu)域組成，2者相互結(jié)合后可起到抑制的作用[4-5]。有研究證實(shí)GSDME可以通過caspase-3切割獲得活性，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡[6]。在肝癌細(xì)胞Bel-7402中，GSDME低表達(dá)，給予雷公藤甲素能夠促進(jìn)活化GSDME形成GSDME-N，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞焦亡[7]。另外，在結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞中，GSDME亦低表達(dá)，給予奧沙利鉑能夠促進(jìn)GSDME表達(dá)，從而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞焦亡[8]。以上研究表明GSDME依賴性細(xì)胞焦亡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而基因藥物干預(yù)治療改善腫瘤細(xì)胞的惡性病變與其抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是目前有關(guān)細(xì)胞焦亡在子宮肌瘤中的研究較少，同時(shí)有關(guān)GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響也尚不清楚。因此，本研究通過體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞，探討GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，293T細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，Transwell 小室(美國 Corning 公司)；細(xì)胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、BCA試劑盒、一抗稀釋液、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗稀釋液和ECL發(fā)光試劑盒由碧云天生物技術(shù)公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent為日本TAKARA公司產(chǎn)品，Caspase-3小鼠單克隆抗體、GSDME兔單克隆抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，批號(hào)9662、9047；β-actin小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)AF5001)。

1.1.2儀器 細(xì)胞勻漿儀(武漢泰普拓公司，型號(hào)TWK-FST32)，高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號(hào)Micro17R]，PCR儀(美國Bio-Rad伯樂，型號(hào)CFX384 Touch)，倒置熒光顯微鏡[日本尼康(Nikon)公司，型號(hào)GPJ9-TS100-F]，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號(hào)FC]，電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司，型號(hào)1658033)，ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1原代子宮肌瘤細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的子宮肌瘤組織或子宮平滑肌細(xì)胞1 cm3，放入4 ℃，無菌、含抗生素的PBS緩沖液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室。PBS潤洗并剪碎至小于1 mm3，離心、靜置、去除上清液、加入Ⅰ型膠原酶(800 000 U/L)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃消化成單個(gè)細(xì)胞并使用PBS終止消化，過濾細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，最后加入細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻放置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁生長24 h， 觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞貼壁生長密度占培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代處理。

1.2.2GSDME慢病毒感染 構(gòu)建GSDME和Vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli DH5ɑ菌，挑選單克隆并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染包裝293T細(xì)胞，收集足量的慢病毒液，稀釋病毒液，4 ℃靜置過夜，離心，去除上清液，并加入細(xì)胞培養(yǎng)基，過濾，收集慢病毒顆粒。取對(duì)數(shù)生長期的原代子宮肌瘤細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分為空載體質(zhì)粒組(Vector組)、轉(zhuǎn)染GSDME載體質(zhì)粒組(OVE-GSDME組)，感染10～12 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，共計(jì)感染3次，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞感染情況，以綠色熒光蛋白表示細(xì)胞感染率。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-PCR) 按照RNA提取試劑盒說明書提取子宮肌瘤細(xì)胞或或子宮平滑肌細(xì)胞總RNA，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的 PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。引物序列：GSDME上游引物為5′-CGTAGAGAGCCAGTCTTCATTT-3′，下游引物為5′-GTTCCAGGACCATGAGTAGTTC-3′；Caspase-3上游引物為5′-AAGCCGAAACTCTTCATC-3′，下游引物為5′- TGAGCATTGACACAATACAC-3′；β-actin上游引物為5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物為5′-CCTGCTCACCACCTTCTTG-3′。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)定量樣本中目的基因的表達(dá)水平。

1.2.4Western blot檢測(cè)GSDME表達(dá) 將子宮肌瘤細(xì)胞研磨并渦旋(5 min/次)，冰上裂解1 h；利用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度，按照30 μg/孔上樣濃度計(jì)算各組上樣體積；制備濃縮膠與分離膠凝膠，上樣；電泳90 min，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜120 min，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)GSDME兔單克隆抗體(1 ∶1 000)、caspase-3小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)及β-actin小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1～2 h；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，加入顯影液顯影并拍照。Caspase-3、GSDME蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值反映，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)觀察 于400×光學(xué)顯微鏡下觀察感染慢病毒后48 h時(shí)子宮肌瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力和遷移能力 (1)侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的濾膜采用ECM gel覆蓋，小室加入內(nèi)含10% FBS培養(yǎng)基0.5 mL，在上室中加入2×106/L濃度的細(xì)胞懸液，每孔200 μL，均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h，4%的多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，于400×顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察穿過膜的細(xì)胞平均數(shù)；計(jì)算細(xì)胞侵襲指數(shù)，細(xì)胞侵襲指數(shù)=(各處理組侵襲細(xì)胞數(shù)/NC mimic組細(xì)胞數(shù))×100%。(2)遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞常規(guī)處理，1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；將小室放置于24孔板內(nèi)，并于下室加入完全培養(yǎng)基(10% FBS)，上室中加入1×105細(xì)胞，小室膜與培養(yǎng)基無氣泡，將24孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板、PBS潤洗小室并擦拭上室殘留細(xì)胞，多聚甲醛固定約15 min，使用0.1%的結(jié)晶紫染色，洗滌、風(fēng)干；于400×顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞遷移指數(shù)，細(xì)胞遷移指數(shù)=(各處理組遷移細(xì)胞數(shù)/NC mimic組細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中caspase-3、GSDME mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，子宮肌瘤細(xì)胞中caspase-3、GSDME mRNA表達(dá)水平低于子宮平滑肌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 GSDME過表達(dá)慢病毒感染子宮肌瘤細(xì)胞

熒光倒置顯微鏡下觀察可見2組細(xì)胞中均有發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，提示有GSDME慢病毒感染，表明慢病毒介導(dǎo)的GSDME過表達(dá)載體構(gòu)建成功。見圖2。

注：(1)與Normal組相比，P<0.01。圖1 子宮肌瘤細(xì)胞caspase-3、GSDME mRNA表達(dá)水平Fig.1 Caspase-3 and GSDME mRNA expression level of uterine fibroids cell

圖2 GSDME過表達(dá)慢病毒感染子宮肌瘤細(xì)胞(100×)Fig.2 GSDME overexpression lentivirus infects uterine leiomyoma cells (100×)

2.3 GSDME過表達(dá)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞焦亡的影響

如圖3所示：OVE-GSDME組子宮肌瘤細(xì)胞GSDME、GSDME-N、Caspase-3及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平均較Vector組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡現(xiàn)象，與Vector組子宮肌瘤細(xì)胞相比，OVE-GSDME組細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，并向一側(cè)“吹泡”，且檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)釋放度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：(1)與Vector組相比，P<0.01。圖3 Caspase-/GSDME信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平Fig.3 Protein expression level of Caspase-/GSDME signaling pathway

注：紅色箭頭表示焦亡細(xì)胞，(1)與Vector組相比，P<0.01。圖4 子宮肌瘤細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)變化及LDH釋放(400×)Fig.4 Morphological changes of pyroptosis and LDH release of uterine fibroids (400×)

2.4 GSDME過表達(dá)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，OVE-GSDME組子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移指數(shù)均較Vector組細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注：A為侵襲實(shí)驗(yàn)，B為遷移實(shí)驗(yàn)，C為統(tǒng)計(jì)結(jié)果；(1)與Vector組相比，P<0.01。圖5 GSDME過表達(dá)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig.5 Effect of GSDME overexpression on the invasion and migration of uterine fibroids cell

3 討論

子宮肌瘤是一種常見的婦科疾病，對(duì)生育能力有著嚴(yán)重的影響。臨床研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤具有較高的發(fā)病率[9]。目前有關(guān)子宮肌瘤的臨床治療主要包括藥物治療和手術(shù)治療，但是藥物治療存在副作用較大、手術(shù)治療存在創(chuàng)傷較大的缺點(diǎn)[9]。因此積極探尋子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制并給予相應(yīng)的干預(yù)治療尤為關(guān)鍵。

GSDME依賴性細(xì)胞焦亡是腫瘤細(xì)胞死亡的一種新形式。既往研究顯示在多種腫瘤細(xì)胞中GSDME呈低表達(dá)，而使用化療藥物后能夠促進(jìn)GSDME表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，從而增加腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[10-12]。因此，通過調(diào)控GSDME依賴性細(xì)胞焦亡已經(jīng)成為治療腫瘤惡性病變的又一新機(jī)制。目前有關(guān)GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展影響及其作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究首先通過qRT-PCR檢測(cè)子宮肌瘤細(xì)胞caspase-3、GSDMEmRNA表達(dá)。結(jié)果顯示與正常的子宮平滑肌細(xì)胞相比，子宮肌瘤細(xì)胞caspase-3、GSDMEmRNA呈低表達(dá)。本研究結(jié)果與以往研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌、胃癌等細(xì)胞GSDME呈低表達(dá)一致[13-14]?；熕幬镯樸K能夠增加結(jié)直腸癌細(xì)胞GSDME過表達(dá)對(duì)順鉑化療藥物的敏感性[15]。另外，吉西他濱能夠激活Caspase-3/GSDME途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞焦亡[16]。以上研究提示過表或是激活GSDME細(xì)胞焦亡途徑能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，從而改善腫瘤疾病進(jìn)展。為此，本研究進(jìn)一步通過構(gòu)建GSDME過表達(dá)慢病毒，觀察GSDME對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞焦亡的影響。結(jié)果顯示2組細(xì)胞均可見慢病毒包裝系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明慢病毒介導(dǎo)的GSDME過表達(dá)成功。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Vector組相比，OVE-GSDME組細(xì)胞GSDME、GSDME-N、Caspase-3及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高。顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡現(xiàn)象，與Vector組相比，OVE-GSDME組細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，并向一側(cè)“吹泡”且LDH釋放度顯著升高。以上研究表明過表達(dá)GSDME能夠誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞焦亡發(fā)生。那么有關(guān)GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞惡性病變的機(jī)制又是如何呢？腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移是其惡性病變的關(guān)鍵[17]。伴隨腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的發(fā)生遠(yuǎn)處正常組織和細(xì)胞亦會(huì)發(fā)生癌變[18]。因此，通過抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是改善腫瘤患者惡性病變的關(guān)鍵。本研究通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OVE-GSDME組子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移指數(shù)，結(jié)果顯示與Vector組相比，OVE-GSDME組子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移指數(shù)均顯著降低，表明激活GSDME依賴性細(xì)胞焦亡能夠通過抑制子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移從而改善子宮肌瘤的惡性病變。但是本研究未能揭示GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制。PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤細(xì)胞的惡性病變密切相關(guān)[19-21]。既往研究顯示抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[22-25]?；谝陨虾笃谡n題組將繼續(xù)探究GSDME依賴性細(xì)胞焦亡能夠通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)從而抑制子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，本研究通過探究GSDME依賴性細(xì)胞焦亡對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示激活GSDME依賴性細(xì)胞焦亡能夠抑制子宮肌瘤細(xì)胞侵襲和遷移。以上研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制。