斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中IL-1β表達(dá)的特點(diǎn)*

趙硯馳， 李化， 李丹， 楊雁竹， 楊曉鳳， 黃江濤， 莫大雙， 舒莉萍*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

20世紀(jì)40年代在研究發(fā)熱的機(jī)制過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)激活的白細(xì)胞可以釋放一種誘導(dǎo)發(fā)熱的因子，將其命名為白細(xì)胞介素1(interleukin 1，IL-1)[1]，可分為IL-1α與IL-1β，其中IL-1β由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(T-lymphocyte，TL)及B淋巴細(xì)胞(B-lymphocyte，BL)等分泌并作用于其他細(xì)胞發(fā)揮促炎效應(yīng)，是炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控因子[2-3]。IL-1β可通過自分泌與旁分泌的方式刺激T細(xì)胞活化和B細(xì)胞的分化，還能促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞功能[4]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β是核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路的下游效應(yīng)因子，是炎癥的重要生物標(biāo)志物[5]。IL-1β能通過血液循環(huán)到達(dá)全身，作用于下丘腦發(fā)揮致熱效應(yīng)以及刺激下丘腦-垂體釋放糖皮質(zhì)激素，進(jìn)而針對IL-1β發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[6]。隨著對IL-1β的深入研究，發(fā)現(xiàn)IL-1β除了參與免疫調(diào)節(jié)功能，還參與造血、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)等多種病理生理過程[7]；IL-1β在哺乳類動物胚胎發(fā)育中同樣起著重要作用，與胚胎數(shù)量及胚胎形態(tài)呈正相關(guān)關(guān)系，小鼠體內(nèi)使用IL-1受體拮抗劑可以阻斷胚胎的順利著床[8]；IL-1β可通過調(diào)控胚胎發(fā)育的質(zhì)量影響妊娠的情況，如檢測培養(yǎng)液中的IL-1β可評估胚胎發(fā)育的潛能與質(zhì)量[9-11]。研究在小鼠、兔子等動物模型中探索IL-1β的功能，但是由于小鼠、兔子等動物模型的飼養(yǎng)成本高昂、繁殖周期較長以及胚胎為宮內(nèi)發(fā)育等特點(diǎn)，無法高通量高效且清晰直觀的探究IL-1β在動物體內(nèi)的變化情況[12-13]。新型模式生物斑馬魚具有體型小、繁殖能力強(qiáng)、體外受精且胚胎透明、易于基因編輯等優(yōu)勢，尤其是其全基因組測序工作已經(jīng)完成，發(fā)現(xiàn)其具有與人類高度保守的發(fā)育與疾病基因[14-16]，然而尚未查到有斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中IL-1β表達(dá)情況的研究，因此本研究將斑馬魚中IL-1β氨基酸序列與人類等9個(gè)不同物種IL-1β氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中探究IL-1β的表達(dá)特點(diǎn)，為IL-1β相關(guān)疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動物來源 選用野生型斑馬魚4 ～ 72 受精后小時(shí)(hourspost-fertilization，hpf )的胚胎，該品系名稱為Tüebingen，屬于本實(shí)驗(yàn)室自行繁殖培育，合格證號為[ SYXK(黔)2018-0001 ]。

1.1.2細(xì)胞及主要試劑 大腸桿菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Taq 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)預(yù)混液、質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化)，F(xiàn)irst Strand 互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA, cDNA)Synthesis Kit、限制性內(nèi)切酶NotⅠ和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、T4 DNA連接酶(美國ThermoFisher)，pGEM-T載體(pGEM-TVector)、T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美國Promega)，DIG RNA Labeling Mix(德國Roche)，原位雜交染色試劑盒BCIP/NBT(美國Vector Lab)；TRIzol Reagent(美國ambion)，ProbeQuantTMG-50 Micro Columns(英國cytiva)。

1.1.3主要儀器 分子雜交箱HL-2000(美國UVP)，PCR儀etc811(北京東勝創(chuàng)新)，高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳)，體視顯微鏡SMZ25(日本尼康)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1斑馬魚養(yǎng)殖 野生型斑馬魚(Tüebingen品系)于室溫(26±2)℃且12 h/12 h照明的循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖，斑馬魚胚胎培養(yǎng)于培養(yǎng)液(0.06 g/L海鹽、0.5mg/L亞甲基藍(lán))中。

1.2.2斑馬魚IL-1β基因氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制 在美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的數(shù)據(jù)庫中查詢IL-1β在人類、斑馬魚、豬、綿羊、水牛、小鼠、大鼠、家兔以及豚尾猴的氨基酸序列，通過多重序列比對軟件(multiple sequence alignment，DNAMAN)進(jìn)行氨基酸序列的相似性比對，最后通過分子進(jìn)化遺傳分析軟件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)制作系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用算法Neighbor-joining進(jìn)行評估。

1.2.3斑馬魚總RNA提取及cDNA合成 分別收集4組72 hpf斑馬魚胚胎(25枚/組)，TRIzol處理、氯仿抽提、異丙醇沉淀，所得產(chǎn)物用75%乙醇洗滌，加適量焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解；將上述總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.4地高辛標(biāo)記的IL-1β反義信使RNA(messenger RNA，mRNA)探針制備 根據(jù)斑馬魚IL-1β基因序列使用Snap Gene軟件設(shè)計(jì)引物：F端為TGAGAAAGCAGAGGAACTTAACC，R端為AATTAACCCTCACTAAAGGGCGAATCTTCATACGCGGTG(劃線位置表示添加的T3啟動子序列)。使用T4DNA連接酶將NotⅠ與EcoRⅠ雙酶切后的pGEM-T載體產(chǎn)物與同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的IL-1β片段產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒重組，瓊脂糖凝膠電泳與測序鑒定無誤后，利用EcoRⅠ將pGEM-T-IL-1β線性化，使用T3轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，純化所得產(chǎn)物后得到反義mRNA探針，置于-80 ℃凍存。

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交 分別收集4、6、9、12、18、24、48及72 hpf的斑馬魚胚胎，25枚/組。利用4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎過夜，甲醇梯度脫水，-20 ℃保存；復(fù)水，蛋白酶K處理48 hpf和72 hpf胚胎，其余時(shí)間的胚胎無需蛋白酶K處理；所有樣本胚胎于分子雜交箱中68 ℃預(yù)雜交4 h；加地高辛標(biāo)記的IL-1β反義mRNA探針雜交14 h；第2天檸檬酸鈉(saline sodium citrate，SSC)緩沖液洗滌，加抗地高辛堿性磷酸酶抗體(antisense digoxigenin alkaline phosphatase，anti-DIG-AP；1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；第3天含Tween-20的馬來酸緩沖液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗滌，加新鮮配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至陽性雜交信號出現(xiàn)，立即使用PBST洗滌終止染色，4% PFA固定，于體視顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同物種間IL-1β的生物信息學(xué)特征

通過對人類、斑馬魚、小鼠、家兔及豬等9個(gè)物種的IL-1β氨基酸序列進(jìn)行相似性比對，結(jié)果顯示斑馬魚IL-1β氨基酸序列與人類、小鼠、家兔以及豬等9個(gè)物種相似度較高(圖1)；后續(xù)繪制9個(gè)物種的IL-1β系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果表明在斑馬魚進(jìn)化過程中與哺乳類動物具有一定保守性。

2.2 pGEM-T- IL-1β重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定結(jié)果

使用氨芐抗性篩選的pGEM-T-IL-1β重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶雙酶切后，將雙酶切鑒定結(jié)果正確的產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，將測序結(jié)果與已知斑馬魚IL-1β基因序列比對，結(jié)果保持一致。見圖3和圖4。

2.3 野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中IL-1β基因的表達(dá)

全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 hpf野生型斑馬魚胚胎中開始觀察到IL-1β陽性雜交信號表達(dá)；6～12 hpf野生型斑馬魚胚胎可見IL-1β廣泛表達(dá)的陽性雜交信號，12 hpf胚胎中表達(dá)尤為明顯；18 hpf野生型斑馬魚胚胎軀干背側(cè)、眼睛以及胚胎中后部的中間細(xì)胞群(intermediate cell mass, ICM)等部位觀察到不同程度的IL-1β陽性雜交信號表達(dá)；24 hpf野生型斑馬魚胚胎整胚中可見IL-1β表達(dá)，頭部、眼睛及心臟部位觀察到強(qiáng)雜交信號；48～72 hpf野生型斑馬魚胚胎軀干部位的肌肉組織中IL-1β表達(dá)尤為明顯。見圖5。

注：英文字母表示不同氨基酸序列，數(shù)字表示氨基酸序列號，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列；-表示該物種與其余物種對比缺失的氨基酸序列片段。圖1 不同物種間IL-1β氨基酸序列的比對Fig.1 Alignment of IL-1β amino acid sequences from multiple species

注：結(jié)點(diǎn)上方數(shù)字為自展值，表示該進(jìn)化分支的可信度。圖2 不同物種間IL-1β的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of IL-1β in multiple species

注：M為DNA Marker Ⅲ，1～4分別為重組質(zhì)粒pGEM-T- IL-1β。圖3 pGEM-T- IL-1β重組質(zhì)粒EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：紅色方框表示所選取限制性內(nèi)切酶及堿基序列，黑色箭頭表示所指限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；紅色曲線表示胸腺嘧啶，綠色曲線表示腺嘌呤，藍(lán)色曲線表示胞嘧啶，黑色曲線表示鳥嘌呤。圖4 pGEM-T-IL-1β重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.4 Sequencing result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid

注：黑色箭頭表示IL-1β表達(dá)最為突出部位。圖5 野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β的表達(dá)(全胚胎原位雜交，×80)Fig.5 Expression of IL-1β during embryonic development of wild-type zebrafish at different time (The whole embryo in situ hybridization,×80)

3 討論

IL-1β是近年來研究受到熱烈關(guān)注的細(xì)胞因子之一，當(dāng)其與相應(yīng)受體結(jié)合后可在信息傳遞以及激活調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等方面發(fā)揮作用，可以刺激機(jī)體組織產(chǎn)生炎癥以及防御反應(yīng)[17-19]。例如可導(dǎo)致NF-κB經(jīng)典信號通路被激活，IκB蛋白降解后使得二聚體得到釋放，使得p65磷酸化激活進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[20-21]；IL-1β還能通過激活p38以及JNK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[21-22]。早期有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎不同發(fā)育階段中，檢測到IL-1β在4細(xì)胞期、8細(xì)胞期及囊胚中出現(xiàn)mRNA水平表達(dá)，此外還有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β蛋白在胚胎所有階段均有表達(dá)，并且伴隨著胚胎成熟蛋白表達(dá)逐漸增加[23]。

本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，斑馬魚IL-1β氨基酸序列與人類IL-1β氨基酸序列相似度較高，從而提示了斑馬魚IL-1β與人類IL-1β功能相似，并在進(jìn)化過程中斑馬魚與哺乳類動物保守性較高；通過成功構(gòu)建pGEM-T-IL-1β重組質(zhì)粒，制備地高辛標(biāo)記的IL-1β反義mRNA探針進(jìn)行全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β在4 hpf斑馬魚胚胎中觀察到陽性雜交信號，12 hpf胚胎中廣泛表達(dá)，18 hpf胚胎軀干背側(cè)以及眼睛等部位表達(dá)外、在中后部的ICM中同樣觀察到IL-1β的陽性雜交信號。由于ICM是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中原始造血發(fā)生的重要區(qū)域之一，相當(dāng)于哺乳類動物胚胎中的卵黃囊，含有大量原始造血細(xì)胞，ICM中的后部造血島位于尾部腹側(cè)區(qū)，標(biāo)志著原始造血的結(jié)束[24-25]，因此結(jié)果提示IL-1β可能與胚胎早期造血發(fā)育密切相關(guān)。24、48及72 hpf時(shí)，IL-1β表達(dá)逐漸從斑馬魚胚胎頭部延伸至全身軀干，幾乎在所有細(xì)胞中表達(dá)，其中在肌肉組織中表達(dá)尤為明顯，提示IL-1β可能是斑馬魚早期胚胎發(fā)育的重要因子。

近年來模式動物已被作為研究和解釋基因功能的手段，被廣泛用于相關(guān)疾病模型研究，而斑馬魚在基因上的高度保守性，使其彌補(bǔ)了非脊椎動物與哺乳類動物之間的“空隙”，以及疾病建模技術(shù)的發(fā)展，例如可以采用成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)與嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino, MO)等技術(shù)的出現(xiàn)，使得利用斑馬魚建立疾病模型方法更為成熟[26]。本研究通過分析斑馬魚胚胎早期發(fā)育中不同時(shí)期IL-1βmRNA的表達(dá)情況，有助于在相關(guān)疾病的斑馬魚模型中更好地探索IL-1β的功能和作用。

綜上所述，本研究不僅通過生物信息學(xué)分析了斑馬魚IL-1β氨基酸序列在進(jìn)化過程中具有相對保守性，并且通過全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1β的表達(dá)貫穿斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程，提示IL-1β可能在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中起著重要作用，為進(jìn)一步探索IL-1β在相關(guān)疾病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。