一株內(nèi)生真菌Talaromyces sp.次級代謝產(chǎn)物及其活性

薛欣怡， 張 翼,2,3， 馮昀鎧， 廖清楠， 胡雪瓊， 劉亞月,2,3*

( 1. 廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院， 廣東 湛江 524088； 2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心， 廣東 深圳 518120； 3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 大連工業(yè)大學(xué)， 遼寧 大連 116034 )

紅樹林是一組多樣化的耐鹽植物，其主要生長在亞熱帶、熱帶地區(qū)的海洋和陸地交匯處，與木本植物、動物、相關(guān)微生物和非生物因素等構(gòu)成了受周期性潮汐影響為特征的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)(Ancheeva et al., 2018)。由于其特殊的生態(tài)環(huán)境，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中形成了一個以真菌和細(xì)菌為主的活躍的微生物群落(Maduranga et al., 2018)。而紅樹林真菌來源的次級代謝產(chǎn)物多具有骨架新穎、生物活性多樣等特點(diǎn)，已成為具有藥理活性的先導(dǎo)化合物的重要來源。自Poch和Gloer(1989)第一次研究紅樹林來源的真菌的代謝產(chǎn)物開始，到2021年為止，研究人員已經(jīng)從325株紅樹林真菌中發(fā)現(xiàn)超過1 387個新的化合物，占海洋真菌代謝產(chǎn)物的25%(Chen et al., 2022)。新化合物結(jié)構(gòu)類型涵蓋聚酮、萜類、生物堿、多肽等，并且具有廣泛的生物活性，如細(xì)胞毒性(Li et al., 2021)、抗菌(后文等，2021)、抗氧化(Yurchenko et al., 2021)、鹵蟲致死(Law et al., 2021)、抗炎(Chen et al., 2021)、酶抑制劑(Xiao et al., 2012)等。進(jìn)一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，這些化合物來自69個不同種屬的紅樹林衍生真菌，包括、、和等。

sp.作為新天然產(chǎn)物的生產(chǎn)者之一占比2%，是一種具有代表性的紅樹內(nèi)生微生物真菌屬，屬于散囊菌目發(fā)菌科藍(lán)狀菌屬，多從土壤、植物、海綿等中分離，已報道的次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的藥理活性，具有重要的應(yīng)用價值(Nicoletti et al., 2018)。如中山大學(xué)佘志剛課題組李翰祥等(2011)從紅樹植物無瓣海桑()來源的次代謝產(chǎn)物中分離得到4個新的化合物talaperoxides A-D，其中化合物B和D對人腫瘤細(xì)胞株MDA-MB-435、MCF-7、HepG2、PC-3和HeLa均具有良好抑制效果，IC值在0.70～2.78 μmol·L之間。劉凡等(2010)從紅樹植物秋茄()來源內(nèi)生真菌spZH-154次代謝產(chǎn)物中分離得到5個已知化合物穗花衫雙黃酮、天精、癸二酸A、大黃素和3,6,8-三羥基-1-甲基呫噸酮，以及2個新化合物，并評估了所有分離化合物的抗菌和體外細(xì)胞毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)癸二酸A和大黃素均具有較好的抗菌和體外細(xì)胞毒性。衛(wèi)白等(2021)從e相關(guān)的培養(yǎng)物中分離出兩種新的azaphilone類化合物talaralbols A-B，活性測試表明tararalbol A在RAW264.7細(xì)胞中顯示出一定的抗炎活性，在濃度為10 μmol·L時的抑制率為31.0%。

楊葉肖槿()作為傳統(tǒng)的民間藥用植物，主要分布在太平洋、印度洋等熱帶海岸地區(qū)，在我國則主要生長于廣西、廣東和海南等沿海一帶，具有廣泛的藥用價值(田艷等，2003)。《新華本草綱要》記載：其性苦、寒；全株能清熱解毒，消腫止痛(Gritto et al., 2015)。2006年印度學(xué)者在對312只小鼠的研究實驗中發(fā)現(xiàn)，其樹皮提取物具有降低膽固醇功能和增強(qiáng)記憶的活性(Vasudevan & Parle, 2006)。Changwong等(2012)在對楊葉肖槿植物提取物研究中分離得到了五個萘醌(mansonone C-H)，AChE抑制活性結(jié)果表明，mansonone E具有較好的抑制活性 [IC值為(23.5 ± 6.4)μmol·L]。因此，以藥用紅樹植物楊葉肖槿為研究對象，從中篩選出AChEI具有一定的可行性。但楊葉肖槿是一類高等植物，具有生長周期長、資源有限、活性物質(zhì)含量低等特點(diǎn)，這為新藥的發(fā)現(xiàn)增加了難度。而內(nèi)生真菌由于與宿主植物長期共處，其產(chǎn)生的藥用活性成分可能與宿主相同或相似的，且具有可人工大規(guī)模、循環(huán)發(fā)酵培養(yǎng)，生長周期短等特點(diǎn)，即可有效的解決紅樹植物的資源不足的問題，同時又能夠產(chǎn)生豐富多樣和活性顯著的化合物，已成為海洋活性先導(dǎo)化合物的主要來源(Eam et al., 2021)。

本研究以1株紅樹植物楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌sp. YX-001為研究對象，采用PDB培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并綜合運(yùn)用硅膠、凝膠柱層析、HPLC和重結(jié)晶等分離手段和MS、1/2D NMR、X-Ray單晶衍射等現(xiàn)代波譜技術(shù)，對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。擬探討以下2個問題：(1)紅樹植物楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的豐富性及主要結(jié)構(gòu)類型。(2)紅樹植物楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物作為AChEI的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌sp. YX-001分離自湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)的紅樹植物楊葉肖槿的根部，采用真菌ITS引物(ITS1和ITS4)對其DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增(Yong et al., 2008)，所得的堿基序列提交到NCBI網(wǎng)站，在Genebank中用Blast進(jìn)行相似性分析，鑒定為sp.。該菌株的堿基序列同時也已提交至Genbank(登錄號：MN826194)，現(xiàn)保存于廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院海洋藥物研究所。

PDB培養(yǎng)基：分別稱取500 mL馬鈴薯汁，20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，20 g海鹽，加純水定容至1 L，滅菌30 min(壓力1×10Pa)，備用。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：碘代硫代乙酰膽堿(acetylthiocholine iodide, ATCI, 批號：DA0048)、AChE(批號：C3389)、牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA, 批號：A1933)均購買于美國Sigma-Aldrich公司；5, 5′-二硫代二硝基苯甲酸(dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB, 批號：D8130)，購買于Ruibio公司；其他實驗試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：霉菌培養(yǎng)箱和生物安全柜，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；WFH-201B多功能紫外透射儀，購自上海精科實業(yè)有限公司；Agilent X射線單晶衍射，銅靶、1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，購自美國Agilent公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海愛朗儀器有限公司；Epoch2酶標(biāo)儀，購自美國BioTek公司；薄層層析版(GF)、柱層析硅膠(200～300目)，均購自青島凱邦；ODS色譜填料，購自日本YMC公司；Sephadex LH-20，購自瑞士GE-Healthcare Bio-sciences公司。

1.3 研究方法

1.3.1 發(fā)酵與提取 將菌株YX-001凍存管置于培養(yǎng)箱過夜活化(溫度28 ℃、濕度80%)，再將菌種接種到預(yù)先滅菌的PDB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3～4 d(100 r·min)，待菌落孢子形成后將種子液接種至含有400 mL培養(yǎng)基的1 L錐形瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，共接種50瓶，總共發(fā)酵培養(yǎng)20 L，于室溫下，靜置培養(yǎng)30 d。

發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，獲得菌絲體和菌液；其中菌絲體用等體積的甲醇浸泡3次，菌液則用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，分別獲得甲醇提取物與乙酸乙酯提取物，將其合并后，再次將粗提取物用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮獲得粗浸膏。

1.3.2 分離與純化 將粗浸膏溶解，加入等體積的硅膠拌樣，而后通過正相硅膠柱進(jìn)行初步分離，以正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇為洗脫劑依次洗脫后，收集得到其中4個組分(Fr. 1～Fr. 4)。各組分經(jīng)TLC檢測后，合并Fr. 2和Fr. 3(記為Fr. A)。對Fr. A進(jìn)行正相硅膠柱層析，用正己烷-乙酸乙酯(體積比為90∶10、70∶30、50∶50、25∶75、0∶100)梯度洗脫，收集得到5個組分(Fr. A-1～Fr. A-5)。組分Fr. A-4經(jīng)正相硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(體積比為50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，收集得到8個組分Fr. A-4-1～Fr. A-4-8。將組分Fr. A-4-4通過半制備HPLC分析，流動相為甲醇-水(體積比為85∶15)，流速為2 mL·min，相應(yīng)獲得化合物(= 18.5 min，7.5 mg)和(= 23.8 min，2.5 mg)。組分Fr. A-4-5通過半制備HPLC分析，流動相為甲醇-水(體積比為90∶10)，流速為2 mL·min，相應(yīng)獲得化合物(= 18.5 min，3.6 mg)。組分Fr. A-3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(洗脫劑為甲醇/二氯甲烷=1∶1,)，分離得到化合物(6.6 mg)。組分Fr. A-2經(jīng)硅膠柱層析，以正己烷-二氯甲烷(體積比70∶30、50∶50、25∶75、0∶100)梯度洗脫，獲得4個組分Fr. A-2-1～ Fr. A-2-4。將組分Fr. A-2-4經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(洗脫劑為甲醇/二氯甲烷=1∶1,)洗脫，獲得化合物(2.6 mg)和(9.6 mg)。Fr. A-2-1置于常溫下靜置一段時間，待溶劑揮發(fā)后得到針狀晶體，而后用正己烷洗滌3次，獲得化合物(17.5 mg)。Fr. A-2-3以二氯甲烷-甲醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，得到的晶體再分別用正己烷和氯仿洗滌3次后，獲得化合物(5.7 mg)。Fr. A-5置于常溫下靜置一段時間，待溶劑揮發(fā)后得到白色固狀不溶物，而后用甲醇洗滌3次，獲得化合物(9.7 mg)。

1.3.3 AChE抑制活性測試 利用文獻(xiàn)報道的Ellman’s比色法(Kaufmann et al., 2011)對各單體化合物的體外AChE抑制活性進(jìn)行了測定。樣品用甲醇溶解，配制成濃度為200 μmol·L的溶液，備用。采用倍半梯度稀釋法對樣品進(jìn)行稀釋后，加入96孔板中，每孔100 μL，待揮干后。再依次往每孔中加入DMSO 1 μL、PBS 49 μL、0.2 U·mL的AChE 10 μL和DTNB 20 μL，置于培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)10 min后，加入20 μL的底物ATCI，繼續(xù)孵育20 min。最后通過酶標(biāo)儀測定溶液在處的光密度值，每組設(shè)3個平行。實驗對照組：將AChE酶溶液換成等體積的BSA溶液，其他同實驗組。空白組：不加入待測樣品，其他同實驗組?？瞻讓φ战M：不加入待測樣品，其他同實驗對照組。本實驗陽性對照為鹽酸多奈哌齊(Paleacu et al., 2002)。通過下述公式計算化合物對AChE的抑制率后利用Origin 9.1計算各單體化合物的IC值。

抑制率= [(-)-(-)]/(-)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

菌株YX-001經(jīng)rDNA的ITS序列測定，測序結(jié)果如下：

CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA

CCGAGTGAGGGCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCC

TTGTCTCATATACCTGTTGCTTCGGCGGGCCCACCG

GGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGTCTGTCCCCGG

GCCCGCGCCCGCCGGAGCGCCCTTTGAACCCTGAT

GAAGATGGGCTGTCTGAGTGATATGAAAATTGTCA

AAACTTTCAACAACGAATCTCTTGGTTCCGGCATCG

ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTG

AATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAA

CGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATG

CCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCT

TGTGTGTTGGGTGTGGTCCCTCCGGGGACCTGCCCG

AAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGT

ATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCG

GAGGTTGGTCACCACCACATCTTTTTTACAAGGTTG

ACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTA

AGCATATCAATAAGCGGAGGAA

圖 1 化合物1-9的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of compounds 1-9

首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇與菌株YX-001序列相似性較高的已有序列，而后進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前20條序列全部屬于sp.，其相似度為99%～100%，覆蓋率為99%～100%。最后利用MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(Sudhir et al., 2016)(圖2)，進(jìn)化樹結(jié)果進(jìn)一步表明YX-001屬于sp.。

圖 2 YX-001菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Evolutionary tree of YX-001

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物淺黃色粉末，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為431 [M]。H NMR 譜圖給出了1個氨基質(zhì)子信號10.12，8個芳香質(zhì)子信號7.85 (dd,= 7.8, 1.1 Hz, 1H)，7.64 (m, 1H)，7.42 (m, 1H)，7.40 (dd,= 7.6, 1.0 Hz, 1H)，7.17 (m, 1H)，7.12 (m, 1H)，7.07 (td,= 7.6, 0.8 Hz, 1H)和6.94 (dd,= 8.0, 1.4 Hz, 1H)，1個孤立質(zhì)子信號6.19 (br s, 1H)，1組亞甲基質(zhì)子信號3.57 (d,= 13.7, 1H)和2.43 (d,= 13.7 Hz, 1H)，3個甲基質(zhì)子信號2.60，1.07和0.86，均為單峰，3個雙鍵烯烴質(zhì)子信號5.90 (dd,= 17.3, 10.8 Hz, 1H)，5.11 (d,= 10.8 Hz, 1H)和5.10 (d,= 17.3 Hz, 1H)以及1個羥基質(zhì)子信號4.08。C NMR譜圖中顯示有25個碳信號：包括3個酮羰基碳信號170.0，168.8和166.4；3個甲基碳信號22.8，23.1和23.9；2個連雜原子的碳信號88.3和81.5；1個亞甲基碳信號40.7；2個sp雜化的季碳信號57.6和40.7；14個成對出現(xiàn)的sp雜化碳信號。HMBC譜圖中(圖3)：H-2′和C-1′，C-5′有相關(guān)；H-4′和C-1′，C-2′有相關(guān)；H-5′和C-3有相關(guān)；H-10和C-2，C-3，C-11有相關(guān)；H-2″和C-1″有相關(guān)；H-5和C-3，C-7，C-9有相關(guān)；H-6和C-5，C-7有相關(guān)；H-8和C-7，C-9有相關(guān)；H-18和C-15，C-20有相關(guān)；H-20和C-19，C-21有相關(guān)；H-21和C-14，C-16，C-19有相關(guān)；以及氨基質(zhì)子和C-11，C-12，C-18有相關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該化合物的核磁數(shù)據(jù)與已知化合物asterrelenin(Li et al., 2005)的核磁數(shù)據(jù)一致，因此鑒定化合物為已知化合物asterrelenin。

圖 3 化合物1的HMBC相關(guān)示意圖Fig. 3 HMBC correlations of Compound 1

化合物淺黃色晶體，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為373 [M]。通過對比H和C NMR數(shù)據(jù)可知(表1)，化合物和具有相似的骨架結(jié)構(gòu)，除了化合物比少一個羰基碳信號170.0和一個甲基信號23.9和2.60，但多1個質(zhì)子信號4.39。通過檢索文獻(xiàn)(Kimura et al., 1982)，確定化合物為已知化合物aszonalenin。

表 1 化合物1和2的1H和13C NMR數(shù)據(jù)表 (500/125 MHz, DMSO)Table 1 1H and 13C NMR data of compounds 1 and 2 (500/125 MHz, DMSO)

化合物為白色晶體，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為374 [M]。通過培養(yǎng)首次成功獲得了化合物的單晶，而后利用銅靶X-Ray單晶衍射技術(shù)確定了該化合物的結(jié)構(gòu)(圖4)，其單晶數(shù)據(jù)如表2所示。結(jié)合單晶結(jié)構(gòu)和分子量可知，化合物的分子式應(yīng)為CHO。但是分析H和C NMR譜圖可知，碳譜中只給出21個碳信號，包括3個酮羰基碳的信號210.2，208.1和197.7；一組成對的烯烴碳信號163.0和122.3；3個甲基碳信號31.2，13.4和12.2；以及13個sp雜化的碳。對比單晶結(jié)構(gòu)，缺少2個甲氧基碳信號，增加1個酮羰基碳信號(表3)。氫譜中也只有1個孤立的烯烴質(zhì)子信號5.61；3個甲基質(zhì)子信號2.11，0.94和0.49；以及17個在高場區(qū)域(1.49～2.79)的質(zhì)子信號，無甲氧基質(zhì)子信號。通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其核磁數(shù)據(jù)與已知化合物Pregn-7-dien-3,6,20-trione ()一致(Lee et al., 2020)。查閱文獻(xiàn)可知，化合物上的雙甲氧基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在一定條件下容易脫去，自動氧化成羰基(Gurst et al., 1973)。因此，我們推測化合物在溶液中化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，C-3上的雙甲氧基會脫去，自動氧化成羰基，生成高度氧化產(chǎn)物Pregn-7-dien-3,6,20-trione ()。通過檢索文獻(xiàn)，確定化合物為已知化合物cladosporisteroid C(Pang et al., 2018)。

圖 4 化合物3的單晶ORTEP圖Fig. 4 Perspective ORTEP drawing of Compound 3

表 2 化合物3的單晶衍射數(shù)據(jù)表Table 2 Crystal parameters of Compound 3

表 3 化合物3和3a的13C NMR數(shù)據(jù)表 Table 3 13C NMR data of compounds 3 and 3a

化合物白色粉末，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為414 [M]。經(jīng)EI分子數(shù)據(jù)庫檢索為sitosterol(Prinsen et al., 2014)。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比一致，確認(rèn)化合物為已知化合物sitosterol。H NMR (400 MHz, CDCl)：5.29 (m, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.41(d,= 5.7 Hz, 1H), 2.24～2.32 (m, 2H), 1.84～1.98(m, 2H), 1.59～1.90 (m, 8H), 1.47～1.57 (m, 3H), 1.13～1.53 (m, 13H), 1.01 (m, 1H), 0.98 (s, 3H), 0.90 (dd,= 6.1, 1.8 Hz, 3H), 0.87 (t,= 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d,= 6.3 Hz, 6H)。

化合物白色針狀晶體，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為396 [M]。TLC分析發(fā)現(xiàn)該化合物在展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1時，值約為0.3，且有紫外，濃硫酸-香草醛溶液下呈現(xiàn)紫黑色。通過與已知化合物麥角甾醇(Mishra et al., 1996)的TLC指紋特征進(jìn)行比對，故確定化合物為ergosterol。H NMR (400 MHz, CDCl)：5.59 (dd,= 5.6, 2.5 Hz, 1H), 5.35～5.44 (m, 1H), 5.16～5.32 (m, 2H), 3.55～3.65 (m, 1H), 2.42～2.50 (m, 1H), 2.22～2.31 (m, 2H), 2.04 (m, 3H), 1.28～1.85 (m, 3H), 1.04 (t,= 6.2 Hz, 4H), 0.91～0.97 (m, 7H), 0.80～0.98 (m, 8H), 0.72～0.84 (m, 3H)。

化合物白色固體，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為210 [M]。C NMR譜顯示分子中含有11個C，包括2個甲基碳信號15.1和11.5；2個酰胺碳信號169.0和164.7；以及7個sp雜化碳信號。H NMR譜中則給出了一個活潑氫信號6.20 (1H, br s)；2個甲基質(zhì)子信號0.89和1.08；以及在高場區(qū)域(1.19～4.23)的11個質(zhì)子信號。通過與文獻(xiàn)對比(Chen et al., 2012)，確定化合物為已知化合物cyclo-Ile-Pro-diketopiperazine。H NMR(CDCl)：6.20( br s, 1H), 4.09(dd,= 10.0, 6.5Hz, 1H), 3.75～3.80(m, 1H), 3.64～3.72(m, 1H), 3.49～3.57(m, 1H), 2.36～2.46(m, 1H), 2.00～2.08(m, 1H), 1.92～2.00 (m, 1H), 1.90～1.98(m, 1H), 1.82～1.94(m, 1H), 1.52～1.60(m, 1H), 1.19～1.31(m, 1H), 1.02(d,= 7.0 Hz, 1H), 0.92(d,= 7.0 Hz, 3H)；C NMR (CDCl)：169.0, 165.3, 63.2, 58.5, 45.7, 39.9, 29.1, 24.5, 22.1, 15.5, 11.2。

化合物白色粉末，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為197 [M]。通過對比化合物和的C和H NMR譜圖發(fā)現(xiàn)，兩者核磁數(shù)據(jù)幾乎一致，除了后者比前者在高場區(qū)域少1個C信號，以及少了2個質(zhì)子信號。因此，結(jié)合文獻(xiàn)核磁數(shù)據(jù)(Yap et al., 2021)，確定化合物為已知化合物cyclo(-Pro-Val)。H NMR(acetone)：6.78 (s, 1H), 4.15(t,= 8.0 Hz , 1H), 3.98(br s, 1H), 3.55(m, 1H), 3.40 (ddd,= 12.0, 8.1, 3.5 Hz, 1H), 2.52(m, 1H), 2.36(m, 1H), 1.95(m, 2H), 1.85(m, 1H), 1.11(d,= 7.0 Hz, 3H), 0.95(d,= 7.1 Hz, 3H)；C NMR (acetone)：170.3, 165.6, 60.7, 59.7, 45.3, 29.1, 29.0, 22.9, 18.8, 17.0。

化合物白色粉末，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為189 [M]。H NMR給出了2個甲基質(zhì)子信號3.85和3.75；1個孤立的烯烴質(zhì)子信號7.65；以及4個芳香質(zhì)子信號7.99 (dd,= 7.8, 2.0 Hz), 7.71(ddd,= 8.5, 6.8, 1.6Hz), 7.35(m), 8.23 (dd,= 8.1, 1.3 Hz)。C NMR譜中給出了11個碳信號，包括1個羰基碳170.3；2個甲基碳57.5和40.0；以及8個成對的烯烴碳信號。通過與文獻(xiàn)對比，確定化合物為4-methoxy-2-methylisoquinolin-1-one(Smetanina et al., 2017)。H NMR(400 MHz, DMSO)：8.23(dd,= 8.1, 1.3 Hz, 1H), 7.99(dd,= 7.8, 2.0 Hz, 1H), 7.71(ddd,= 8.5, 6.8, 1.6 Hz, 1H), 7.65(m, 1H), 7.35(m, 3H), 3.85(d,= 1.39 Hz, 1H), 3.75(s, 3H)；C NMR (100 MHz, DMSO)：170.3, 142.1, 138.9, 131.4, 131.2, 125.8, 125.6, 122.2, 116.3, 57.5, 40.0。

化合物白色粉末，EI質(zhì)譜顯示分子離子峰為158 [M]，經(jīng)EI分子數(shù)據(jù)庫檢索為allantoin(Liu et al., 2020)，分子式為CHO。與文獻(xiàn)核磁數(shù)據(jù)對比一致，確認(rèn)化合物為已知化合物allantoin。H NMR (400 MHz, DMSO)：10.41 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 6.89 (d,= 7.6 Hz, 1H), 5.67 (s, 2H), 5.34 (d,= 8.1 Hz, 1H)；C NMR (100 MHz, DMSO)：173.5, 157.4, 156.4, 62.7。

圖 5 化合物3在一定條件下氧化成化合物3a的反應(yīng)Fig. 5 Oxidation reaction of compounds 3 to 3a under certain conditions

2.3 AChE抑制活性測試結(jié)果

化合物-的AChE抑制活性測試結(jié)果表明：化合物和均對AChE顯示出一定的抑制活性，IC值分別為81.5、105.8 μmol·L，其他化合物不顯示明顯的抑制活性(IC>200 μmol·L)。

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外對紅樹植物楊葉肖槿的研究主要集中在植物本身的化學(xué)成分及藥理活性上，但尚未見對其來源內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物及生物活性的有關(guān)報道。本研究綜合運(yùn)用硅膠柱層析和HPLC等多種色譜分離手段，首次對楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌sp.YX-001次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，共從中分離得到了9個化合物，包括6個含氮類化合物asterrelenin ()、aszonalenin ()、cyclo-Ile-Pro-diketopiperazine ()、cyclo(-Pro-Val) ()、4-methoxy-2-methylisoquinolin-1-one ()和allantoin ()，3個萜類化合物 cladosporisteroid C ()、sitosterol ()、ergosterol ()。查閱文獻(xiàn)可知(Chen et al., 2022)，在紅樹林真菌代謝產(chǎn)物中，生物堿和萜類化合物均是紅樹林真菌次級代謝產(chǎn)物的主要結(jié)構(gòu)類型，分別占比12%和19%，僅次于聚酮化合物(63%)。同時，生物堿及萜類化合物均是具有廣泛藥理活性的一類天然產(chǎn)物。查閱文獻(xiàn)可知：化合物-與具有一定的抗炎(Wardecki et al., 2015；Kurano et al., 2018；Lee et al., 2021)、抗蟲(Meza-menchaca et al., 2019；Pramanik et al., 2020)、抗真菌(Choub et al., 2021)、抗癌(Vo et al., 2020; El-Sherif et al., 2020)、抗高血壓(Chen et al., 2014)等多種生物活性；化合物、和的生物活性暫未見報道；化合物目前只被報道不具備明顯的抗菌活性及細(xì)胞毒性(Eamvijarn et al., 2013; May et al., 2016)。本文首次對上述化合物的AChE抑制活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：化合物和顯示一定的AChE抑制活性，IC值分別為81.5、105.8 μmol·L。本研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了楊葉肖槿的樹皮提取物的記憶增強(qiáng)功能(Solomon et al., 2015)，同時表明紅樹植物楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物具有開發(fā)成為新的AChEI的潛力。因此，本論文的研究為抗AD新藥的研究提供新的資源菌，為進(jìn)一步開發(fā)與再利用紅樹植物楊葉肖槿來源內(nèi)生真菌資源奠定了基礎(chǔ)。