谷子PAL基因家族全基因組的鑒定和表達(dá)分析

孟亞軒， 孫穎琦， 趙心月， 王鳳霞， 甕巧云， 劉穎慧

( 河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院， 河北 張家口 075000 )

苯丙氨酸解氫酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，參與木質(zhì)素及酚類化合物的合成過(guò)程，廣泛存在于各種植物中(Fraser & Chapple, 2011；蓋江濤等，2016)。Koukol和Comm(1961)在大麥()中首次提取出PAL蛋白，后續(xù)馬鈴薯()(Joos & Hahl, 1992)、煙草()(Reichert et al., 2009)等高等植物也相繼分離純化得到PAL蛋白。楊郁文等(2017)研究發(fā)現(xiàn)PAL多以同源四聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平等多層次調(diào)控方式，在植物防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)段，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(楊郁文等，2017)?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控HCA類酚類、類黃酮等產(chǎn)物的合成影響果實(shí)品質(zhì)(張麗之等，2018)。此外，廣泛參與植物響應(yīng)病原菌侵染過(guò)程。楊會(huì)曉等(2019)研究表明與香蕉抗病性密切相關(guān)，在枯萎病菌侵染過(guò)程中高豐度表達(dá)?；钚栽黾优c苯丙烷類產(chǎn)物的產(chǎn)量提高密切相關(guān)，其活性水平隨發(fā)育階段、細(xì)胞和組織的分化、不同應(yīng)激刺激而改變。Lister等(1996)首次發(fā)現(xiàn)活性與蘋(píng)果()果實(shí)類黃酮含量存在顯著正相關(guān)。楊會(huì)曉等(2019)研究發(fā)現(xiàn)在香蕉()果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程高豐度表達(dá)，次級(jí)代謝物質(zhì)在這一階段具有較高的表達(dá)效率。Olsen等(2008)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥()1、2基因在氮脅迫和溫度變化過(guò)程中高豐度表達(dá)，并伴隨類黃酮化合物的積累。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，多種植物基因組測(cè)序相繼完成，植物中基因的功能陸續(xù)得到研究。大豆()1-1、2-1、2-3在木質(zhì)素合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用(候鵬等，2016)；10強(qiáng)烈響應(yīng)紋枯病菌侵染玉米()過(guò)程(鄧路長(zhǎng)等，2019)；參與山葡萄()花色苷的積累(陳蒙等，2018)?；蚪M學(xué)的迅速發(fā)展，標(biāo)志著在分子水平上進(jìn)行系統(tǒng)分析已成為當(dāng)下生物學(xué)研究的主流趨勢(shì)(王燦等，2020)。谷子()為一年生禾本科作物，基因組小且為二倍體，具有抗旱性強(qiáng)、生育期短、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是挖掘作物抗旱基因和解讀抗逆分子機(jī)制的重要作物(宋健等，2020)。谷子生育期內(nèi)需水量較少，屬環(huán)境友好型作物(宋健等，2019)，抗逆育種靶向基因資源的研究已成為谷子增收工作的重要環(huán)節(jié)(Nadeem et al., 2020)。谷子基因組測(cè)序的完成為谷子研究搭建了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，標(biāo)志著谷子遺傳研究已進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代(Bennetzen et al., 2012；Zhang et al., 2012)?；蚣易鍙V泛存在于植物中，但關(guān)于谷子基因家族的研究卻鮮有報(bào)道。為明確谷子基因家族在逆境脅迫過(guò)程中的作用機(jī)理，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)谷子基因家族進(jìn)行鑒定，分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及進(jìn)化方式，并構(gòu)建家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，以期為谷子基因家族的生物學(xué)功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試谷子()品種為一年生‘張雜谷8號(hào)’，盆栽于河北北方學(xué)院農(nóng)場(chǎng)，分別置于自然光、黑暗、紅光、藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光條件下照射24 h，取幼嫩葉片，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 谷子PAL基因的鑒定及蛋白序列分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)查找并下載PAL蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件(Pfam號(hào)碼：00221)(Finn et al., 2008)，利用plant Genes 基因組獲取Gene stable ID及Transcript stable ID，通過(guò)CDD和InterProScan對(duì)Gramene網(wǎng)站獲取的序列進(jìn)行篩選鑒定，去除冗余，得到PAL蛋白序列、染色體定位等基因信息(Marchler et al., 2009; Hunter et al., 2009)。利用ProtParam數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)序列信息得到氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)等用于推測(cè)蛋白質(zhì)的相關(guān)因子(宋健等，2020)。

1.3 基因的染色體定位

通過(guò)MG2C在線工具，利用谷子基因位置信息以及從Ensemble Plants查詢到的谷子染色體長(zhǎng)度，繪制基因的染色體定位。

1.4 谷子PAL蛋白分析及進(jìn)化樹(shù)繪制

使用ProSite和Clustal X在線軟件對(duì)谷子PAL蛋白結(jié)構(gòu)域位置進(jìn)行序列對(duì)齊。通過(guò)MEGA 6.0軟件中的銜接法(neighbor-joining, NJ)，采用泊松模型繪制蛋白進(jìn)化樹(shù)(bootstrap為1 000)(Larkin et al., 2007；Sigrist et al., 2010)。通過(guò)上述方法對(duì)二穗短柄草()、高粱()、狗尾草()等54個(gè)PAL家族成員繪制蛋白進(jìn)化樹(shù)(bootstrap為默認(rèn)值)。

1.5 Motif獲取及蛋白預(yù)測(cè)

在MEME網(wǎng)站得到谷子PAL的motif模式(最小寬度設(shè)置為60，最大寬度設(shè)置為200)(Bailey et al., 2009)；利用Weblogo分析得出PAL結(jié)構(gòu)域motif(Stacks per Line設(shè)置為100)；在SWISS-MODEL網(wǎng)站中利用其各基因位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高基因組成的保守序列預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)并得到螺旋模式(Kiefer et al., 2009)，并根據(jù)上述方法對(duì)二穗短柄草、水稻等物種的PAL蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析對(duì)比各物種的蛋白結(jié)構(gòu)差異。

1.6 PAL同源共線性分析

在PAL系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)上，谷子和水稻()的直系同源片段已得到鑒定。利用Ensembl Plants網(wǎng)站的基因組比較功能得到谷子和水稻同源物的同源共線圖(Wang et al., 2012)。通過(guò)其染色體定位及基因位置，在Adobe Illustrator CS4軟件繪制谷子和水稻同系物的同源共線圖，分析其共線性。

1.7 PAL基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲得谷子基因的序列信息，使用GSDS 2.0在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析其編碼序列，得到內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)模型(Hu et al., 2015)。在谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到起始密碼子上游1 500 bp區(qū)域序列，利用plantCARE分析其順式作用元件，通過(guò)GSDS 2.0將其可視化(Lescot et al., 2002)。

1.8 谷子PAL基因表達(dá)模式分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲得11個(gè)基因在不同誘導(dǎo)處理下的表達(dá)模式，包括強(qiáng)光誘導(dǎo)2周的葉片、強(qiáng)光誘導(dǎo)1周的芽、黑暗誘導(dǎo)的地上組織、紅光誘導(dǎo)的地上組織、正常光誘導(dǎo)的根、干旱誘導(dǎo)的根、尿素誘導(dǎo)的根、強(qiáng)光誘導(dǎo)的穗，利用TBtools繪制熱圖(Chen et al., 2020)。

1.9 谷子PAL基因在不同光質(zhì)照射下的RT-qPCR分析

利用DNAMAN設(shè)計(jì)引物，選擇為內(nèi)參基因。使用植物總RNA試劑盒提取RNA(天根生化科技有限公司)，F(xiàn)astQuant RT Kit合成cDNA，使用Agilent 3000P熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)；采用2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子PAL基因家族鑒定

谷子中共鑒定11個(gè)家族基因，分別命名為1～11(表1)。11個(gè)PAL蛋白序列差異較?。喊被衢L(zhǎng)度為698 aa(SiPAL1、SiPAL8)～891 aa(SiPAL7)，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度2 142 bp(3)～4 610 bp(2)，分子質(zhì)量為74.99 kD(SiPAL8)～95.01 kD(SiPAL7)，等電點(diǎn)為5.82(5)～6.52(6)，含有1個(gè)(3、4、5)～6個(gè)(7)外顯子。從表1可以看出，位于1號(hào)染色體的5個(gè)基因(1～5)具有相似的編碼蛋白特征，且基因位置緊密排列在一起，位于7號(hào)染色體的3個(gè)基因(9～11)雖然緊密排列，但其編碼蛋白的特征卻相差較大。所有PAL蛋白的等電點(diǎn)均在5.82～6.52之間，說(shuō)明苯丙氨酸解氫酶具有酸性特征，PAL蛋白可能在弱酸性的環(huán)境中發(fā)揮作用。家族基因除7(6)外，外顯子數(shù)量較小，推測(cè)10個(gè)家族基因具有相似的功能。

從基因的染色體分布發(fā)現(xiàn)，1號(hào)染色體有5個(gè)緊密排列的基因，分布的基因數(shù)量最多；7號(hào)染色體具有3個(gè)基因且緊密排列，其他染色體上沒(méi)有成簇基因分布(表1，圖1)；此外，基因不均勻分布在染色體各個(gè)部位，其中1號(hào)染色體和7號(hào)染色體基因形成簇狀分布。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)的Gbrowse功能比對(duì)成簇分布的基因家族成員與側(cè)翼編碼蛋白質(zhì)基因位置關(guān)系，參考Holub(2001)對(duì)基因簇的界定，暗示谷子家族基因可通過(guò)串聯(lián)復(fù)制實(shí)現(xiàn)家族擴(kuò)增。

表 1 谷子PAL基因家族的信息Table 1 Information of millet PAL gene family

圖 1 谷子PAL基因家族的染色體分布Fig. 1 Chromosome distribution of millet PAL gene family

2.2 谷子PAL蛋白進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用蛋白序列對(duì)齊文件，通過(guò)銜接法繪制出谷子PAL的進(jìn)化樹(shù)(圖2)。由圖2可知，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可分為3組蛋白，第1組和第2組蛋白數(shù)量相同且分支分布情況相似，此外小部分PAL蛋白的臨界值達(dá)到100。進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)淝闆r表明，這兩組基因可能經(jīng)過(guò)復(fù)制的方式得到或者執(zhí)行相似基因功能。由進(jìn)化樹(shù)聚類分析得出，相同PAL蛋白結(jié)構(gòu)域與同一基因擴(kuò)增或復(fù)制的蛋白聚合在一起，如SiPAL6和SiPAL9分散復(fù)制聚在一起，相同結(jié)構(gòu)域聚合為一組。另外，SiPAL7獨(dú)自分支為一組，說(shuō)明SiPAL7可能具有不同的進(jìn)化軌跡。

圖 2 PAL蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of PAL protein

2.3 不同物種PAL蛋白進(jìn)化關(guān)系

利用MEGA 6.0軟件將單、雙子葉共6個(gè)物種的54個(gè)PAL蛋白利用銜接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3)。由圖3可知，基因家族演化分析中選用二穗短柄草9個(gè)，高粱8個(gè)、狗尾草11個(gè)、水稻10個(gè)、擬南芥5個(gè)PAL蛋白發(fā)現(xiàn)，7個(gè)親緣關(guān)系組中部分物種PAL蛋白呈家族性聚集，不同綱目物種之間的PAL蛋白也具有較高的同源性。

黑色為谷子，青色為二穗短柄草，黃色為高粱，藍(lán)色為狗尾草，紫色為擬南芥，紅色為水稻。Black is Setaria italica, cyan is Brachypodium distachyon, yellow is Sorghum bicolor, blue is Setaria viridis, purple is Arabidopsis thaliana, red is Oryza sativa.圖 3 不同物種PAL蛋白進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of PAL protein in different species

2.4 谷子PAL蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)ProSite軟件對(duì)谷子PAL蛋白的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有PAL蛋白均具有保守的PAL 結(jié)構(gòu)域。由圖4可知，SiPAL7蛋白除含有PAL結(jié)構(gòu)域外還具有HtRna 結(jié)構(gòu)域、HGTP 結(jié)構(gòu)域，其中HtRNA 結(jié)構(gòu)域可能調(diào)控氨酰腺苷酸的合成，HGTP 結(jié)構(gòu)域可能與相關(guān)蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，SiPAL7的氨基酸長(zhǎng)度最長(zhǎng)，擁有蛋白結(jié)構(gòu)域最多，可能與其具有最多的外顯子(6個(gè))有關(guān)，意味著擁有更多的遺傳信息；SiPAL11雖同樣具有較長(zhǎng)的氨基酸序列，但只含有PAL蛋白結(jié)構(gòu)域，暗示SiPAL11可能擁有一些低復(fù)雜度的蛋白結(jié)構(gòu)域。通過(guò)MEME軟件對(duì)谷子PAL蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，PAL結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成較為穩(wěn)定。

圖 4 谷子PAL蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig. 4 Schematic diagram of PAL protein domain of millet

2.5 谷子PAL蛋白3D結(jié)構(gòu)與序列分析

利用SWISS-MODEL軟件分析各基因位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的保守基序，預(yù)測(cè)谷子PAL蛋白的3D結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，谷子PAL蛋白的PAL 3D 結(jié)構(gòu)在對(duì)稱基礎(chǔ)上具有較多的螺旋、折疊方式(圖5：A)。通過(guò)Superpose Version 1.0將各物種間的PAL蛋白3D結(jié)構(gòu)對(duì)比，比值越小證明物種間PAL蛋白結(jié)構(gòu)越相似。由表2可知，狗尾草與谷子3D結(jié)構(gòu)相差最小(0.38)，與進(jìn)化樹(shù)分支聚類情況一致，證明兩者具有最近的親緣關(guān)系，相差最大的是谷子與二穗短柄草(3.93)，這與谷子和二穗短柄草為不同綱目的物種相對(duì)應(yīng)。通過(guò)蛋白3D結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)PAL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)大多具有對(duì)稱性，說(shuō)明其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元具有一定的相似性，從基因進(jìn)化來(lái)看，這種對(duì)稱性代表著基因存在復(fù)制融合。

A. PAL氨基酸序列； B. PAL蛋白3D結(jié)構(gòu)示意圖。A. PAL amino acid sequence； B. PAL protein 3D structure schematic diagram.圖 5 PAL蛋白的3D結(jié)構(gòu)及序列Fig. 5 3D structure and sequence of PAL protein

2.6 谷子、水稻PAL同源共線性分析

利用Ensembl Plants網(wǎng)站synteny功能得到谷子和水稻同源物的同源共線圖。通過(guò)染色體定位及基因位置，繪制谷子和水稻同源物的同源共線圖(圖6僅展示代表成員)。圖6結(jié)果表明，谷子11個(gè)家族成員均可在水稻中找到共線基因，如含有020626100、020626400等的水稻2號(hào)染色體基因組區(qū)域與谷子1號(hào)染色體的基因組塊具有共線性，含有050150900的水稻5號(hào)染色體基因組區(qū)域與谷子3號(hào)染色體的基因組塊具有共線性；同樣含有040518100、040518400的水稻4號(hào)染色體基因組區(qū)域與谷子7號(hào)染色體組塊具有共線性。

圖 6 谷子和水稻PAL基因共線性分析Fig. 6 Collinearity analysis of PAL gene in millet and rice

2.7 PAL基因結(jié)構(gòu)分析

利用GSDS 2.0對(duì)谷子序列信息分析并可視化，得到基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)模型圖(圖7：A)發(fā)現(xiàn)，基因大多數(shù)只具有1個(gè)內(nèi)含子(1、2、6、8、9、10、11)，且這些基因的外顯子結(jié)構(gòu)及大小具有一定的相似性，這種結(jié)構(gòu)間的相似性說(shuō)明他們可能在植物的生化過(guò)程中執(zhí)行相同的作用。3、4、5同樣具有相同的外顯子結(jié)構(gòu)，但均不含有內(nèi)含子。7擁有最多的內(nèi)含子數(shù)量(5)。

將plantCARE分析得到的順式作用元件區(qū)域可視化，得到順式作用元件分布圖，圖7：B結(jié)果顯示，家族中含有多種激素信號(hào)響應(yīng)元件和環(huán)境信號(hào)響應(yīng)元件。其中，分布最廣的為茉莉酸響應(yīng)元件，存在于所有基因中，暗示基因通過(guò)響應(yīng)植物內(nèi)源激素參與植物抗病過(guò)程；分布最少的元件為胚乳表達(dá)元件，只存在于9中；其他不同類型順式作用元件如脅迫元件、光響應(yīng)等不均勻分布在各個(gè)位置?？梢?jiàn)，家族基因在谷子發(fā)育、抗病及脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

A. 防御與應(yīng)激響應(yīng); B. 赤霉素響應(yīng); C. 脫落酸響應(yīng); D. 生長(zhǎng)素響應(yīng); E. 光響應(yīng); F. 茉莉酸響應(yīng); G. 玉米醇溶蛋白調(diào)控元件; H. 分生組織誘導(dǎo); I. MYB結(jié)合位點(diǎn); J. 缺氧誘導(dǎo); K. 胚乳表達(dá); L. 低溫脅迫。A. Defense and stress responsiveness; B. Gibberellin responsiveness; C. Abscisic acid responsiveness; D. Auxin responsiveness; E. Light responsiveness; F. MeJA responsiveness; G. Zein metabolism regulatory elements; H. Meristem induction; I. MYB binding site; J. Hypoxia induction; K. Endosperm expression; L. Low temperature stress.圖 7 PAL基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)及順式作用元件Fig. 7 PAL gene intron-exon structure and cis-acting elements

2.8 谷子PAL基因表達(dá)分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的11個(gè)基因在谷子不同組織中面對(duì)不同非生物脅迫的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用TBtools將結(jié)果可視化，繪制熱圖，如圖8所示，所有基因均檢測(cè)到表達(dá)量，其中1、2、8、10在強(qiáng)光誘導(dǎo)1周的芽、黑暗誘導(dǎo)的地上組織、紅光誘導(dǎo)的地上組織、正常光誘導(dǎo)的根、干旱誘導(dǎo)的根、尿素誘導(dǎo)的根、強(qiáng)光誘導(dǎo)的穗中均具有明顯高于其他基因的表達(dá)量； 在強(qiáng)光誘導(dǎo)生長(zhǎng)2周葉片的表達(dá)量中只有2具有微弱表達(dá)，其他基因幾乎不表達(dá)。3、6、9在谷子不同組織中的表達(dá)量均明顯低于其他基因；家族基因?yàn)檎T導(dǎo)型表達(dá)，即在干旱或強(qiáng)光等誘導(dǎo)條件下，表達(dá)量為增強(qiáng)或抑制，存在著不同基因的差異性。

A. 強(qiáng)光誘導(dǎo)葉片2周; B. 強(qiáng)光誘導(dǎo)芽1周; C. 黑暗誘導(dǎo)的地上組織; D. 紅光誘導(dǎo)的地上組織; E. 尿素誘導(dǎo)的根; F. 強(qiáng)光誘導(dǎo)的穗; G. 正常光誘導(dǎo)的根; H.干旱誘導(dǎo)的根。A. Strong light induced leaves for two weeks; B. Strong light for one week; C. Dark induced above-ground tissue; D. Red light induced above-ground tissue; E. Urea induced roots; F. Bright light-induced spikes; G. Normal light-induced roots; H. Drought-induced roots.圖 8 谷子PAL基因在不同誘導(dǎo)下各組織的表達(dá)量Fig. 8 Expression of millet PAL gene in various tissues under different induction

2.9 谷子PAL基因在不同光質(zhì)照射下的RT-qPCR分析

由圖9可知，紅光照射下，1、8、5上調(diào)表達(dá)，其余基因與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出不同程度的下降。藍(lán)光照射下1、8、10等上調(diào)表達(dá)，7與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。黑暗處理下，1、8、2等上調(diào)表達(dá)，其他基因表現(xiàn)為下調(diào)，其中6表達(dá)量極低。遠(yuǎn)紅光照射下，1、8、2、10、5、11等上調(diào)表達(dá)。家族基因在不同光質(zhì)照射下表達(dá)量變化明顯，說(shuō)明基因在谷子光形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，1、8為主要成員。

Control. 正常光誘導(dǎo); RL. 紅光誘導(dǎo); BL. 藍(lán)光誘導(dǎo); DL. 黑暗誘導(dǎo); FRL. 遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)。Control. Normal light induction; RL. Red light induction; BL. Blue light inducation; DL. Dark induction; FEL. Far-red light induction.圖 9 谷子PAL基因在不同光質(zhì)下的表達(dá)量Fig. 9 Expression of PAL gene in millet under different light qualities

表 2 PAL蛋白疊加比對(duì)Table 2 PAL protein stacking ratio

3 討論與結(jié)論

PAL是與植物抗性相關(guān)的關(guān)鍵酶(孫宇蛟等，2018)，對(duì)其研究備受關(guān)注，前人已對(duì)多物種的基因家族進(jìn)行了分析，如玉米(鄧路長(zhǎng)等，2019)、蘋(píng)果(張麗之等，2018)和陸地棉()(楊郁文等，2017)。其中，玉米和陸地棉均含有13個(gè)基因，蘋(píng)果含有8個(gè)家族成員，與本研究中谷子鑒定出11個(gè)基因結(jié)果相差不大，說(shuō)明基因以小基因家族形式存在，在物種分化過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)大幅度擴(kuò)增現(xiàn)象。谷子基因編碼的蛋白中有部分蛋白具有相近的分子量、等電點(diǎn)等，與香蕉(楊會(huì)曉等，2019)和青天葵()(黃瓊林等，2016)的研究較一致，說(shuō)明其編碼的蛋白具有相似的功能。

基因復(fù)制事件是基因家族擴(kuò)張的主要?jiǎng)恿?。本研究發(fā)現(xiàn)，谷子基因呈簇狀分布，在蘋(píng)果(張麗之等，2018)、大豆(候鵬等，2016)、西瓜()(Dong & Shang, 2013)中PAL染色體定位同樣存在簇狀分布現(xiàn)象，其中西瓜12個(gè)基因中有7個(gè)串聯(lián)排列在4號(hào)染色體，2個(gè)串聯(lián)排列在7號(hào)染色體上，其余單獨(dú)排列在染色體2號(hào)、3號(hào)、8號(hào)上，與谷子染色體分布有著高度的相似性，說(shuō)明在基因家族的擴(kuò)增中存在串聯(lián)復(fù)制、分散復(fù)制、片段復(fù)制(郭棟等，2019)。共線性分析發(fā)現(xiàn)，11個(gè)谷子基因家族成員在水稻染色體組中均存在共線性關(guān)系，說(shuō)明基因在進(jìn)化過(guò)程中保守性較高。

根據(jù)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，谷子PAL蛋白進(jìn)化樹(shù)分為3組，SiPAL7獨(dú)自進(jìn)化為一支，說(shuō)明SiPAL7與其他成員同源性較低，可能具有不同起源或進(jìn)化軌跡，本研究結(jié)果與陸地棉(楊郁文等，2017)具有一致性。系譜樹(shù)內(nèi)同一進(jìn)化枝成員基因結(jié)構(gòu)較為一致，具有較高的保守性。但是，Ⅲ組成員7與其他家族成員相比基因結(jié)構(gòu)差異較大，擁有更多的內(nèi)含子數(shù)量，這暗示基因家族具有多樣化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。基因家族成員結(jié)構(gòu)的差異性可能會(huì)影響其功能活性。

啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，基因家族不僅含有大量非生物脅迫元件，而且存在光響應(yīng)、激素響應(yīng)等多種類型元件，不同家族成員所含元件數(shù)量和種類不同，說(shuō)明基因家族廣泛參與不同生物學(xué)調(diào)控過(guò)程，不同基因具有其特異調(diào)控模式。

植物在遭受干旱、高溫等脅迫時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生大量活性氧(ROS)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。苯丙烷代謝途徑中產(chǎn)生的類黃酮等次生代謝產(chǎn)物，具有清除ROS的抗氧化活性(楊會(huì)曉等，2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因家族多為誘導(dǎo)型表達(dá)，在受到不同脅迫刺激時(shí)，表達(dá)量迅速提升，說(shuō)明基因家族廣泛響應(yīng)不同非生物脅迫，類黃酮等次級(jí)代謝產(chǎn)物在非生物脅迫過(guò)程中可能具有較高的合成活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，部分基因具有相似的響應(yīng)模式，說(shuō)明可能存在功能冗余。光質(zhì)在植株建成、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。熒光定量分析結(jié)果表明，在不同光照條件下，基因家族差異表達(dá)。5在紅光、紅遠(yuǎn)光高表達(dá)，11在紅遠(yuǎn)光高表達(dá)等，這些變化說(shuō)明基因家族在谷子光調(diào)節(jié)途徑中存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，不同基因存在功能分化。