基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討人參皂苷Rb1腸道菌轉(zhuǎn)化物治療胃癌的作用機制

萬彥,敖慧

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

胃癌是癌癥相關(guān)死亡率的第二大原因，也是全球第四大常見癌癥[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多通路以及多靶點[2]。目前，胃癌的治療手段多樣，多以化療以及手術(shù)療法居多。然而，這些方法有著不可忽視的副作用，例如化療后的不良反應(yīng)以及預(yù)后不佳等[3]。因此，有必要尋找安全有效且多靶點的藥物。

研究表明，人參皂苷可有效防治胃癌[4]。人參皂苷Rb1是人參含量最高的皂苷原型成分之一，但膜通透性差，口服生物利用度低，較難被人體腸道直接吸收[5,6]。本課題組前期研究表明，人參皂苷Rb1并無明顯的體外抗胃癌活性，常經(jīng)腸道菌群的脫糖作用轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷而轉(zhuǎn)運到上皮膜被腸道吸收。因此，腸道菌群轉(zhuǎn)化的代謝物可能是人參皂苷Rb1在體內(nèi)發(fā)揮藥效的主要形式[7,8]。人參皂苷Rd、F2是人參皂苷Rb1主要腸道菌群轉(zhuǎn)換產(chǎn)物[9]。有研究表明人參皂苷Rd和人參皂苷F2具有一定的抗胃癌活性，但其機制不清晰[10,11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)就是將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點或網(wǎng)絡(luò)模塊的關(guān)系，由尋找單一靶點轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要是通過系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法進行研究，使用統(tǒng)計學(xué)、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等數(shù)學(xué)手段，能夠在分子水平上更好地理解細胞以及器官的行為，加速藥物靶點的確認以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物[13-15]，對于研究多靶點藥物作用機制具有一定優(yōu)勢。本研究擬將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用于預(yù)測人參皂苷Rd和人參皂苷F2的抗胃癌作用機制，為人參皂苷的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 人參皂苷F2及Rd的靶點預(yù)測

Swiss Target Prediction是一種基于與已知化合物的二維和三維結(jié)構(gòu)的相似性來預(yù)測化合物的靶標(biāo)的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫由280 381個小分子與2 686個靶標(biāo)間的相互作用構(gòu)成，其中大多數(shù)靶標(biāo)是人的蛋白。Swiss Target Prediction為每個預(yù)測靶標(biāo)提供一個分數(shù)，以評估預(yù)測正確的可能性。因此本實驗通過Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫獲得人參皂苷F2和Rd的潛在靶點。

1.2 胃癌相關(guān)基因的篩選

以“gastric cancer ”為關(guān)鍵詞在Disgenet(http://www.disgenet.org/)、Malacards(http://www.malacards.org/)和Omim(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中獲得胃癌的靶點，并對獲得的靶點進行去重，得到疾病的潛在靶點。

1.3 核心靶點垂釣及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

BisoGenet旨在評估來自蛋白質(zhì)組學(xué)或基因組學(xué)實驗的基因或蛋白質(zhì)組之間的功能關(guān)系的突出程度，通過Bisogenet內(nèi)在整合數(shù)據(jù)庫對輸入的靶點進行拓展分析可以得到一組更全面的PPI網(wǎng)絡(luò)。在Cytoscape 3.8.2軟件中，將人參皂苷F2、Rd和胃癌的潛在靶點分別輸入Bisogenet插件中，點擊“Gene identifiers only”進入下一步“DataSettings”,勾選“Protein Protein Interaction”選項，點擊確定分別構(gòu)建人參皂苷F2、Rd和胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后利用Merged工具將人參皂苷F2、Rd的PPI網(wǎng)絡(luò)分別與胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)取交集獲得人參皂苷Rd治療胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)和人參皂苷F2治療胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用CytoNCA插件計算兩組PPI網(wǎng)絡(luò)的屬性值。在人參皂苷Rd治療胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)中先利用Degree值的中位數(shù)篩選一次，再利用Degree、Betweenness和Clossness中位數(shù)進行三次篩選獲得人參皂苷Rd治療胃癌的核心靶點。同法獲得人參皂苷F2治療胃癌的核心靶點。

1.4 藥物-核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.8.2軟件分別對人參皂苷F2治療胃癌的核心靶點和人參皂苷Rd治療胃癌的核心靶點構(gòu)建藥物-核心靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析

分別將人參皂苷F2治療胃癌的核心靶點和人參皂苷Rd治療胃癌的核心靶點導(dǎo)入到Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫中，物種選擇“homo sapiens”，點擊Costom Analysis進入下一步。在Enrichment頁面設(shè)置P≤0.05，勾選GO Biological Processes選項進行基因本體論(Gene Ontology，GO)生物學(xué)過程分析；勾選KEGG Pathway選項進行KEGG分析。得到GO分析結(jié)果和KEGG富集結(jié)果。

2 實驗結(jié)果

2.1 人參皂苷F2、Rd及胃癌的潛在靶點

根據(jù)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫得到人參皂苷F2靶點20個，人參皂苷Rd靶點23個。在disgenet、malacards和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲得胃癌相關(guān)靶點34個、32個、140個，合并以上檢索結(jié)果并刪去重復(fù)值，共得到胃癌相關(guān)靶點189個。

2.2 人參皂苷F2及Rd治療胃癌關(guān)鍵靶點篩選

2.2.1 人參皂苷Rd治療胃癌關(guān)鍵靶點篩選

構(gòu)建人參皂苷Rd的作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，其中包括節(jié)點1 269個，節(jié)點之間的相互關(guān)系28 398個;構(gòu)建胃癌疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，其中具有5 804個節(jié)點，節(jié)點之間的相互關(guān)系149 080個。隨后使用Merge插件，提取人參皂苷Rd治療胃癌起效的交集靶點網(wǎng)絡(luò)，通過Degree、Betweenness和Clossness中位數(shù)進行篩選，具體參數(shù)如表1所示，最后得到人參皂苷Rd治療疾病的關(guān)鍵靶點，例如NTRK1、Fibronectin 1、MCM2、AKT1 等64個靶點，如圖1、表2所示。

表1 人參皂苷Rd、F2治療胃癌關(guān)鍵靶點篩選參數(shù)

圖1 人參皂苷Rd治療胃癌關(guān)鍵靶點的拓撲網(wǎng)絡(luò)

表2 人參皂苷Rd關(guān)鍵靶點詳細信息

(見續(xù)表2) (續(xù)表2)

2.2.2 人參皂苷F2治療胃癌關(guān)鍵靶點篩選

構(gòu)建人參皂苷F2的作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，其中包括節(jié)點1 125個，節(jié)點之間的相互關(guān)系23 363個;構(gòu)建胃癌疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，其中具有5 804個節(jié)點，節(jié)點之間的相互關(guān)系149 080個。隨后使用Merge插件，提取人參皂苷F2治療胃癌起效的交集靶點網(wǎng)絡(luò)，通過Degree、Betweenness和Clossness中位數(shù)進行篩選，具體參數(shù)如表1所示，最后得到人參皂苷F2治療疾病的關(guān)鍵靶點，例如HNRNPU、AURKA、IKBKB、AKT1等56個靶點，如圖2、表3所示。

表3 人參皂苷F2關(guān)鍵靶點詳細信息

(見續(xù)表3) (續(xù)表3)

圖2 人參皂苷F2治療胃癌關(guān)鍵靶點的拓撲網(wǎng)絡(luò)

2.3 人參皂苷Rd及人參皂苷F2-核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3.1 人參皂苷Rd-核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

人參皂苷Rd-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)如圖3所示，包擴NTRK1、FN1、MCM2、IKBKG、AKT1等在內(nèi)的64個靶點。

2.3.2 人參皂苷F2-核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

人參皂苷F2-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)如圖4所示，包擴HNRNPU、AURKA、IKBKB、AKT1等在內(nèi)的56個靶點。

2.4 人參皂苷Rd及人參皂苷F2關(guān)鍵靶點的GO和KEGG分析

2.4.1 人參皂苷Rd關(guān)鍵靶點的GO和KEGG分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO分析，共包含了869個生物過程(BP)，109個細胞組分(CC)以及104個分子功能(MF)。對富集排名靠前的BP10條，CC10條及MF10條進行可視化展示，如圖5所示。其中，生物學(xué)過程細胞周期過程的調(diào)節(jié)、DNA代謝過程的調(diào)節(jié)、細胞對 DNA 損傷刺激的反應(yīng)、細胞對氮化合物的反應(yīng)、有絲分裂細胞周期的調(diào)節(jié)及有絲分裂細胞周期等；細胞組分涉及粘著斑、囊泡腔、細胞-基質(zhì)連接、主軸及分泌顆粒管腔等；分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、無序結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等等。KEGG分析結(jié)果顯示了P<0.05的富集條目后制作氣泡圖(圖6)，包括PI3K-Akt 信號通路， FoxO信號通路，ErbB信號通路，HIF-1t信號通路，MAPK信號通路等等。

圖3 人參皂苷Rd-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

圖4 人參皂苷F2-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

圖5 人參皂苷Rd治療胃癌關(guān)鍵靶點的GO生物功能富集分析

圖6 人參皂苷Rd治療胃癌關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

2.4.2 人參皂苷F2關(guān)鍵靶點的GO和KEGG分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO分析，共包含了801個生物過程，93個細胞組分以及86個分子功能。對富集排名靠前的BP10條，CC10條及MF10條進行可視化展示，如圖7所示。其中，生物學(xué)過程包括細胞對氮化合物的反應(yīng)、細胞周期過程的調(diào)節(jié)、細胞對有機氮化合物的反應(yīng)、細胞對 DNA 損傷刺激的反應(yīng)、DNA代謝過程的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)、對生長因子的反應(yīng)及細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)等；細胞組分涉及粘著斑、細胞-基質(zhì)連接、囊泡腔、主軸及分泌顆粒管腔等；分子功能包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等等。KEGG分析結(jié)果顯示了P<0.05的富集條目后制作氣泡圖(圖8)，包括PI3K-Akt信號通路，MAPK信號通路， NF-kB信號通路等等。

圖7 人參皂苷F2治療胃癌關(guān)鍵靶點的GO生物功能富集分析

圖8 人參皂苷F2治療胃癌關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

本研究通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫得到人參皂苷Rd靶點23個，人參皂苷F2靶點20個；在disgenet、malacards和OMIM數(shù)據(jù)庫中共篩選出胃癌相關(guān)靶點189個。隨后將人參皂苷Rd、F2的PPI網(wǎng)絡(luò)分別與胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)取交集獲得人參皂苷Rd治療胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)和人參皂苷F2治療胃癌的PPI網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過篩選后得到人參皂苷Rd治療胃癌的關(guān)鍵靶點64個以及人參皂苷F2治療胃癌的關(guān)鍵靶點56個。GO分析結(jié)果顯示人參皂苷Rd共包含了869個生物過程，109個細胞組分以及104個分子功能；人參皂苷F2包含了801個生物過程，93個細胞組分以及86個分子功能。此外，KEGG結(jié)果表明人參皂苷Rd治療胃癌所涉及的通路包括PI3K-Akt 信號通路， FoxO信號通路，ErbB信號通路，HIF-1t信號通路，MAPK信號通路等等；而人參皂苷F2治療胃癌所涉及的通路包括PI3K-Akt 信號通路，MAPK信號通路， NF-kB信號通路等等。

分析人參皂苷Rd及人參皂苷F2的生物學(xué)過程可知，上述兩種人參皂苷的生物學(xué)過程主要與細胞對氮化合物的反應(yīng)、細胞周期過程的調(diào)節(jié)、細胞對 DNA 損傷刺激的反應(yīng)、DNA代謝過程的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)等有關(guān)。而這些生物學(xué)過程皆與細胞凋亡有所關(guān)聯(lián)，表明上述兩種人參皂苷的抗胃癌途徑可能與凋亡途徑相關(guān)。此外，KEGG結(jié)果表明人參皂苷Rd及人參皂苷F2調(diào)節(jié)胃癌的相關(guān)通路及其的一致。其中，PI3K-Akt 信號通路以及MAPK信號通路是調(diào)控胃癌的關(guān)鍵信號通路，已有相關(guān)實驗證實上述兩條通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。例如，PI3K-Akt通路的異常激活可誘導(dǎo)胃癌細胞存活和轉(zhuǎn)移，也可通過誘導(dǎo)抗凋亡基因和促凋亡基因的失調(diào)而導(dǎo)致癌細胞逃脫凋亡[16,17]；MAPK通路通過COX-2的誘導(dǎo)參與了NF-κB的激活，促進了GC細胞的增殖等[18]。此外，大量文獻報道，通過調(diào)控PI3K-Akt 信號通路以及MAPK信號通路，可誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，從而發(fā)揮藥物的抗胃癌活性[19-24]。例如，人參皂苷通過激活MAPK通路，促進細胞自噬，并在G2/M過渡期間阻斷胃癌細胞周期，從而發(fā)揮抗胃癌活性；血竭素高氯酸鹽抑制PI3K/Akt和NF-κB的激活，上調(diào)P53的表達，促進胃癌細胞凋亡等等。因此，筆者認為人參皂苷Rd及人參皂苷F2可能通過抑制PI3K-Akt 信號通路，MAPK信號通路， HIF-1t信號通路，ErbB信號通路，特別是PI3K-Akt 信號通路以及MAPK信號通路，促進胃癌凋亡、抑制增殖，從而發(fā)揮治療胃癌的作用。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果僅是一種預(yù)測，且存在一定缺陷。故有必要進行體內(nèi)外實驗加以驗證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在實際應(yīng)用時應(yīng)注重與體內(nèi)外實驗和臨床研究相結(jié)合，以驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是預(yù)測藥物與疾病靶點的學(xué)科，但并不能直接推測藥物對疾病是否具有活性。筆者對已知的數(shù)據(jù)庫進行了檢索，并未發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1抗胃癌的報道。人參皂苷Rb1的腸道菌群轉(zhuǎn)化物-人參皂苷Rd及F2已被報道具有抗胃癌活性，但是其機制卻并不清晰。因此，本研究是基于已知人參皂苷Rb1的腸道菌群轉(zhuǎn)化物-人參皂苷Rd及F2具有抗胃癌活性的前提下，對其未知的抗癌機制的進行預(yù)測，為后續(xù)實驗提供方向。值得注意的是，人參皂苷Rb1的腸道菌群轉(zhuǎn)化物-人參皂苷Rd及F2在體內(nèi)是同時存在的。盡管兩者結(jié)構(gòu)相似，但仍有所不同，兩者之間的抗胃癌作用機制可能有所區(qū)別。因此，本課題分別對人參皂苷Rd及F2的抗胃癌機制進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，結(jié)果表明除了共有通路PI3K-Akt信號通路與MAPK信號通路有相關(guān)性的差距外，人參皂苷Rd似乎還可以通過FoxO信號通路，ErbB信號通路和HIF-1t信號通路調(diào)控胃癌，而人參皂苷F2似乎還能通過NF-κB通路調(diào)控胃癌。上述結(jié)果表明兩種人參皂苷可能因其結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其抗癌機制上的不同，盡管需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，人參皂苷Rd及人參皂苷F2治療胃癌可能是通過參與機體的細胞對氮化合物的反應(yīng)、細胞周期過程的調(diào)節(jié)、細胞對 DNA 損傷刺激的反應(yīng)、DNA代謝過程的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)等生物過程，調(diào)控PI3K-Akt 信號通路，MAPK信號通路， HIF-1t信號通路，ErbB信號通路等發(fā)揮抗胃癌活性。本課題通過利用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，充分理解了蛋白與蛋白間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對人參皂苷Rd及人參皂苷F2治療胃癌的可能作用機制進行探討。該方法亦體現(xiàn)了中藥活性成分治療疾病的多靶點及多通路協(xié)同作用的特征。這為下一步研究人參皂苷Rd及人參皂苷F2治療胃癌的分子機制提供方向，亦為臨床合理應(yīng)用人參皂苷提供了科學(xué)依據(jù)。