基于響應(yīng)面法的茯苓液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及其活性成分含量測定

黃群，周應(yīng)娟，陳光欣，李晨，萬德光，李羿▲

(1成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有利尿滲濕和健脾寧心之效[1]。茯苓含有多糖類、三萜類和氨基酸等多種化合物，其中茯苓多糖和三萜是其主要活性成分[2]。茯苓作為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，是多種中藥方劑配伍的要藥，配伍率達70%以上。在2019新冠肺炎治療方案中，由茯苓配伍的多個中藥組方療效較為顯著。茯苓還是眾多中成藥及食品的原料，應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等多個領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。

茯苓產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年遞增的態(tài)勢，2019年茯苓全國產(chǎn)量已達17萬余噸。茯苓的野生資源因無序采挖而致逐漸枯竭，目前主要依賴于人工栽培，但存在需要消耗大量的松木資源(每生產(chǎn)1噸茯苓需要砍伐20 m3松木)、生產(chǎn)周期長和易受環(huán)境條件影響等不足，難以滿足社會的需求[3-6]。為貫徹習(xí)近平總書記“寧要綠水青山，不要金山銀山”的生態(tài)文明理念[7]，保護生態(tài)環(huán)境，亟待尋找新的茯苓生產(chǎn)方式。使用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)茯苓，具有生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)工藝易調(diào)控等優(yōu)勢，在短期內(nèi)可獲得大量茯苓代謝產(chǎn)物，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可有效解決茯苓人工栽培中的不足。目前，對液茯苓體發(fā)酵培養(yǎng)工藝優(yōu)化的相關(guān)研究多集中于搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的氮源和碳源的種類[8-11]，且僅對液體發(fā)酵茯苓多糖類成分研究較多[12-15]。基于此，本研究采用響應(yīng)面法，從茯苓菌種的接種量、碳源濃度與氮源濃度三個方面來優(yōu)化茯苓的液體發(fā)酵工藝，以優(yōu)化后的工藝條件生產(chǎn)液體發(fā)酵茯苓，比較栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的總多糖和總?cè)频暮坎町悾云跒閷ふ臆蜍咝碌纳a(chǎn)方式和促進茯苓資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試驗材料

茯苓菌種購自巴中市通江縣；栽培茯苓購自云南普洱，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院李羿教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核。

1.2 實驗試劑

無水葡萄糖(福晨天津化學(xué)試劑有限公司，批號：20200811)；酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：01-014)；蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：01-001)；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都埃法生物科技有限公司，批號：77-52-1)；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(成都埃法生物科技有限公司，批號：AF9053027)。

1.3 實驗儀器

CHA-SA數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器(常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠)； SW-CJ-2FD潔凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)； KQ100DB超聲水浴鍋(昆山市超聲儀器有限公司)；UTC16D0007雙光束紫外可見分光光度計(翱藝儀器上海有限公司)。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備[8]

2.1.1 茯苓菌種種子液的制作

照表1茯苓液體種子培養(yǎng)基配方配置培養(yǎng)基，分裝滅菌備用。從菌袋中挑取適量茯苓菌塊，接種至液體種子培養(yǎng)基中。28℃，離心力6.24 g條件下?lián)u瓶振蕩培養(yǎng)5 d。

表1 培養(yǎng)基組方

2.1.2 茯苓種子液的甘油保存

吸取0.7 mL “2.1.1”項下種子液于1.5 mL無菌EP管中，加入無菌甘油0.3 mL，混勻后-20℃低溫保存[16-17]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝

單因素預(yù)實驗結(jié)果表明：接種量以5.00%為宜，碳源濃度以3.00%為宜，氮源濃度以1.00%為宜。以響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化液體發(fā)酵茯苓培養(yǎng)工藝，把茯苓菌絲干質(zhì)量作為指標(biāo)，對A接種量、B碳源濃度、C氮源濃度進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗[18]。各影響因素與水平見表2。

表2 因素與水平表

將優(yōu)化得到液體發(fā)酵茯苓最佳培養(yǎng)工藝進行3次平行實驗，以驗證該工藝的穩(wěn)定性。

2.3 茯苓總多糖的提取及含量測定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.16 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加水至2 mL，依次加入5%的苯酚溶液和濃硫酸，混勻后50℃水浴加熱20 min，然后冷水浴10 min，495 nm處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

2.3.2 總多糖含量測定

稱取液體發(fā)酵茯苓和栽培茯苓粉末各1 g，加入1 moL/L 的NaOH溶液50 mL，50℃超聲提取1 h。取濾液0.01 mL于試管中，同法顯色，測定紫外吸光度計算總多糖含量。

2.4 茯苓總?cè)频奶崛〖昂繙y定

2.4.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.2 g/L的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中蒸干，依次加入5%香草醛-冰醋酸和高氯酸溶液，混勻后50℃水浴20 min，然后冷水浴10 min，加冰醋酸5 mL混勻，在550 nm處測定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20-21]。

2.4.2 總?cè)坪繙y定

各稱取液體發(fā)酵茯苓和栽培茯苓粉末1 g，加入甲醇50 mL，50℃超聲提取3次，每次1 h，合并濾液后定容至10 mL。取0.1 mL，蒸干，同法顯色，測定紫外吸光度計算其總?cè)坪俊?/p>

2.5 栽培茯苓和發(fā)酵茯苓的性狀比較

分別取少量云南茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓菌絲粉末于載玻片上，滴入蒸餾水后攪拌均勻，蓋上蓋玻片，用濾紙吸干多余的液體。將制備好的臨時裝片置于顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

通過響應(yīng)面設(shè)計法對液體發(fā)酵茯苓三個培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化分析，得到的方法及結(jié)果見表3，方差分析見表4，各自變量間交互作用響應(yīng)面三維圖見圖1。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

圖1 響應(yīng)面三維圖

在單因素試驗基礎(chǔ)上開展響應(yīng)面試驗，以菌絲體干質(zhì)量(Y)作為響應(yīng)值，對A接種量、B碳源濃度、C氮源濃度進行設(shè)計試驗，得到茯苓菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面回歸模擬方程：Y=7.32+0.063A+0.014B-0.13C+0.82AB-0.35AC+1.00BC+0.95A2-0.22B2-0.82C2。

通過響應(yīng)面分析法預(yù)測得到的最佳工藝為：接種量6.93%、碳源濃度3.15%、氮源濃度0.96%，預(yù)測所得茯苓菌絲體干質(zhì)量應(yīng)為8.27 g/L?？紤]操作方便等因素，將其修正為：接種量6.90%、碳源濃度3.10%、氮源濃度1.00%。

在最佳培養(yǎng)工藝條件下，進行平行3次驗證試驗，得到茯苓菌絲干質(zhì)量為(8.26±0.05)g/L(RSD=0.57%，n=3)，偏差率0.12%，說明該回歸模型建立合理，具有良好的預(yù)測性。

3.2 茯苓總多糖含量測定結(jié)果

栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的多糖含量分別為76.63%和44.80%，液體發(fā)酵茯苓的總多糖含量低于栽培茯苓。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的總多糖測定結(jié)果見表5。

表5 栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的多糖含量

3.3 茯苓總?cè)坪繙y定結(jié)果

栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的總?cè)坪糠謩e為5.76%和2.48%，栽培茯苓的三萜類化合物含量高于液體發(fā)酵茯苓。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的總?cè)茰y定結(jié)果見表6。

表6 栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的三萜類含量

3.4 性狀比較結(jié)果

栽培茯苓粉末呈白色，顯微鏡下，菌絲呈不規(guī)則團塊狀，有分枝，見圖4；發(fā)酵茯苓粉末呈淺棕黃色，顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)細長，分枝較多，且存在隔膜，見圖5。通過以上顯微結(jié)構(gòu)圖可知，液體發(fā)酵茯苓菌絲分枝較栽培茯苓更多，其原因在于液體發(fā)酵具有易分散、發(fā)菌點多、萌發(fā)快的優(yōu)點；但其粗壯程度不及傳統(tǒng)栽培茯苓，其原因在于栽培茯苓菌絲纏結(jié)緊密，成熟度更高。

4 討論

茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件均會對茯苓菌絲的生長和代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響，而液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度、氮源濃度和茯苓液體菌種接種量是其液體發(fā)酵中的重要影響因素。因此，本研究采用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化茯苓液體發(fā)酵中碳源濃度、氮源濃度和接種量三個因素，篩選其最佳液體發(fā)酵工藝。由表4可知該響應(yīng)面模型p<0.01極顯著，失擬項p>0.05不顯著，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，擬合程度高。3個單因素對菌絲體干質(zhì)量的影響主次順序為C>B>A，即：氮源濃度>碳源濃度>接種量。篩選的最佳茯苓液體發(fā)酵工藝為：接種量6.90%、碳源濃度3.10%、氮源濃度1.00%，此工藝下得到的菌絲干質(zhì)量為(8.26±0.05)g/L。驗證實驗表明：該工藝精密度和重復(fù)性較好，穩(wěn)定可行。

測定并比較液體發(fā)酵茯苓和栽培茯苓總多糖和總?cè)频暮?，液體發(fā)酵茯苓和栽培茯苓的總多糖含量分別為 44.80%和76.63%，總?cè)坪糠謩e為2.48%和5.74%，液體發(fā)酵茯苓中總多糖和總?cè)频暮糠謩e是栽培茯苓的0.58倍和0.43倍。液體發(fā)酵茯苓總多糖和總?cè)扑骄?，其原因在于栽培茯苓和液體發(fā)酵茯苓的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式存在較大的不同，且茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)時間(5 d)顯著短于栽培茯苓培養(yǎng)時間(180～240 d)，從而導(dǎo)致兩者的代謝途徑和代謝產(chǎn)物含量存在差異。研究表明，茯苓液體發(fā)酵中菌絲體生長時，可同時合成菌絲體多糖和向培養(yǎng)液中分泌胞外多糖，且胞外多糖含量高于菌絲體多糖[22]。由于中藥成分的積累是一個動態(tài)的過程，其涉及環(huán)境、遺傳和生物多樣性等因素[23]。三萜類化合物的合成受次生代謝途徑和環(huán)境因子的調(diào)控，當(dāng)溫度升高時可促進茯苓總多糖等活性成分的積累，但同時也會一定程度抑制其總?cè)频瘸煞值姆e累。因此，自然環(huán)境下晝夜溫差較大等因素有利于栽培茯苓總?cè)瞥煞值姆e累，導(dǎo)致其總?cè)瞥煞趾扛哂谝后w發(fā)酵茯苓。

綜上，液體發(fā)酵生產(chǎn)茯苓具有生產(chǎn)周期短和不受環(huán)境影響的優(yōu)勢，可較快速地產(chǎn)生茯苓多糖和三萜類化合物等重要次生代謝產(chǎn)物，有望為茯苓資源的開發(fā)和解決困擾茯苓生產(chǎn)多年菌木矛盾的難題提供新思路。筆者計劃將進一步開展液體發(fā)酵茯苓和栽培茯苓的藥效學(xué)比較的研究，以期為茯苓液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝的應(yīng)用推廣和茯苓資源的開發(fā)打下基礎(chǔ)。