新疆伊犁州小麥條銹菌生理小種鑒定及毒性分析

劉 琦, 陳 利, 曾明昊, 艾尼賽·賽米, 馬澤宇, 馬占鴻

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室, 烏魯木齊 830052;2. 中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學系, 北京 100193)

由條形柄銹菌小麥?；蚉ucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst)引起的小麥條銹病是對我國小麥危害最重的氣傳性真菌病害,也是新疆麥區(qū)重要病害之一[1-3]。該病害具有發(fā)生范圍廣、危害程度重、大區(qū)流行等特點。病原菌營活體專性寄生,喜冷涼,其無性孢子可高空遠距離傳播[4]。近些年來,小麥條銹菌新的生理小種不斷出現(xiàn),我國小麥品種抗病性漸漸喪失[5]。目前,防治小麥條銹病較為經(jīng)濟有效的措施是選育和推廣抗病品種[6-7]。小麥條銹菌生理小種具有高度變異特性,是造成病害流行的主要因素,使得小麥品種的抗病性較易被新毒性小種所克服而在3～5年內(nèi)因抗性喪失而失去利用價值[8]。20世紀50年代以來,我國有7～8次大規(guī)模小麥品種更替,均是由于小麥品種對條銹菌生理小種的抗病性喪失導致[9]。已有研究認為,條銹菌在伊犁河谷地區(qū)海拔669 m可以順利越夏、越冬,完成周年循環(huán),形成一個相對獨立的流行區(qū)系[10]。

近年來,新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州小麥條銹病發(fā)生危害日趨嚴重,本研究通過廣泛采集伊犁州小麥條銹病樣品,采用我國通用鑒別寄主對其進行生理小種鑒定和毒性分析,以期能夠掌握伊犁州小麥條銹菌毒性組成,為指導新疆小麥抗病育種、品種合理布局提供重要科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥條銹菌樣品的采集

2020年5月采集新疆伊犁州小麥條銹菌樣品149份(表1)。采集初始發(fā)病樣品(即銹孢子堆新鮮飽滿,病斑清晰的葉片),單獨平放于采樣袋內(nèi),記錄樣本詳細信息(采集地點、經(jīng)緯度、海拔高度等),置于實驗室4℃干燥器中冷藏備用。

表1 2020年小麥條銹菌樣品采集信息

1.2 小麥條銹菌樣品純化與擴繁

1.2.1小麥種植

小麥條銹菌的分離、擴繁與鑒定均在新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院人工氣候室進行。于接種前10～15 d種植感病小麥品種‘銘賢169’。挑選粒大飽滿的種子,均勻播種于裝有營養(yǎng)土的小花盆(d=10 cm)中,每盆約播15粒,置于(11.8±3)℃人工氣候室培養(yǎng)備用。

1.2.2菌種活化

于接種前一天,用流水沖洗掉病葉表面的塵土雜質,葉片正面向上平整地鋪放于鋪有濕潤濾紙的直徑10 cm的培養(yǎng)皿底部,蓋上培養(yǎng)皿蓋,于4℃黑暗條件下保濕8～12 h。待產(chǎn)生鮮黃色夏孢子時,即可用于接種。

1.2.3接種

當小麥第1葉完全展開時接種小麥條銹菌。去除葉片表面蠟質后,噴施0.01%吐溫80水溶液,然后挑取單個夏孢子堆轉移至小麥葉片表面的液滴上。接種完成后將花盆置于泡沫箱(相對濕度為80%)中黑暗保濕24～36 h,溫度為(11.8±3)℃。隨后轉移至人工氣候室內(nèi)罩上玻璃罩繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為(11.8±3)℃、L∥D=12 h∥12h,光照強度為 8 000～10 000 lx,約10 d左右葉片出現(xiàn)潛育斑。

1.2.4菌種擴繁

接種后15～20 d,葉片表面逐漸產(chǎn)生夏孢子堆后進行菌種收集及擴繁。用玻璃棒輕敲小麥葉片,將夏孢子收集至離心管中,存于4℃干燥器中冷藏備用。重復接種3～5次直至擴繁到10～15 mg足夠用于生理小種鑒定的夏孢子量。

1.3 小麥條銹菌生理小種鑒定

1.3.1小麥條銹菌鑒別寄主

以感病品種‘銘賢169’作為對照,采用中國通用的19個小麥條銹菌鑒別寄主品種對本研究采集的小麥條銹菌生理小種進行鑒定。鑒別寄主及其所含抗性基因如表2所示。

表2 鑒別寄主及其所攜帶的抗條銹基因

1.3.2生理小種鑒定

待鑒別寄主麥苗長至1葉1心期用10 mL噴瓶噴霧接菌。與擴繁接種方法相同,將純化擴繁的菌種接種于鑒別寄主小麥葉片上,待指示品種‘銘賢169’充分發(fā)病后,逐葉調查并記載每個分離物在各個鑒別寄主上的侵染型。侵染型分級按 0、0;、1、2、3、4共6級標準(表3)進行劃分,其中0～2級為抗病(R),3～4級為感病(S)。根據(jù)侵染型類型判定條銹菌生理小種類型[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

毒性分析采用二元歸類法,即抗病型(0～2級)記作“0”,感病型(3～4級)記作“1”,每個寄主品種作為一個毒性位點,基于簡單的相似矩陣,利用Popgen 1.32軟件計算毒性多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性位點百分率、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、Nei’s遺傳距離,Nei’s遺傳分化指數(shù)。根據(jù)Nei’s遺傳距離,用NTsys 2.10e軟件對條銹菌群體進行聚類分析[12]。

表3 小麥條銹病菌苗期侵染型分級標準

2 結果與分析

2.1 149個小麥條銹菌樣品的生理小種鑒定結果

149份樣品可明確歸類為28個生理小種類型,并將其分為以下幾個小種類群,其中毒性譜較窄的古老小種有CYR 17、CYR 18、CYR 24和CYR 26;洛10類群的小種有CYR 28和洛10-2;洛13類群的生理小種有CYR 29、洛13-2和洛13-3;Hybrid 46類群的生理小種有CYR 30、CYR 31、CYR 32、Hy-4、Hy-7和Hy-8;水源11類群的生理小種有Su 11-1、Su 11-2、Su 11-4、Su 11-7、Su 11-8、Su 11-9、Su 11-10、Su 11-12、Su 11-13和CYR 33;貴農(nóng)22類群的生理小種有CYR 34、貴22-13和貴22-14(表4)。

表4 2020年伊犁州小麥條銹菌生理小種鑒定結果

2.2 致病類群分析

2020年新疆伊犁州監(jiān)測到CYR 17、CYR 18、CYR 24、CYR 26生理小種共15份,占比10.07%;洛10類群11份,占比7.38%;洛13類群9份,占比6.04%;Hybrid 46類群27份,占比18.12%;水源11類群66份,占比44.30%;貴農(nóng)22類群21份,占比14.09%(表4)。

監(jiān)測結果表明,水源11類群、Hybrid 46類群和貴農(nóng)22類群是危害新疆伊犁州小麥生產(chǎn)的主要致病類群,3個類群出現(xiàn)頻率為76.51%。水源11類群出現(xiàn)頻率最高,出現(xiàn)頻率高達44.30%,為伊犁州的優(yōu)勢致病類群。

2.3 小種類型分析

在Hybrid 46類群中,CYR 32小種出現(xiàn)頻率最高,為8.05%,是本類群中的優(yōu)勢小種; 而CYR 30和CYR 31出現(xiàn)頻率均為4.03%,呈現(xiàn)低頻發(fā)生,不再具備流行優(yōu)勢。

水源11類群中,CYR 33小種出現(xiàn)頻率為14.09%,為2020年監(jiān)測到的該類群中及伊犁州所有類群中出現(xiàn)頻率最高的生理小種。且CYR 33小種分布范圍廣,在所監(jiān)測的7個縣(鄉(xiāng))中均被檢出,由此判定CYR 33為新疆伊犁州小麥條銹菌優(yōu)勢生理小種。其次是Su11-1和Su11-12,出現(xiàn)頻率為12.75%和8.05%,Su11-2、Su11-4、Su11-7、Su11-8、Su11-9、Su11-10、Su11-13出現(xiàn)頻率在0.67%～2.68%。

貴農(nóng)22類群中,CYR 34(貴農(nóng)22-9)小種出現(xiàn)頻率為7.38%,已上升為該類群中的優(yōu)勢小種,也是目前公認致病力最強的生理小種,在19個鑒別寄主中,只對‘中四’和‘T.speltaalbum’無毒力,是值得關注和警惕的生理小種。

2.4 毒性頻率分析

由毒性頻率分析結果(表5)可知,149個條銹菌樣品對20種抗條銹基因均具有毒性,毒性頻率為14.09%～87.25%,表明該地區(qū)條銹菌群體的毒性基因類型多樣。小麥條銹菌在攜帶抗條銹基因Yr1、YrA、Yr3、Yr6、YrSu、Yr9的載體品種上的毒性頻率為87.25%、86.58%、83.89%、83.89%、72.48%、73.15%,均大于70%,表明這些抗性基因在伊犁州基本失效;而在攜帶抗條銹基因YrVir1、YrVir2、YrVir3、YrVir4(‘維爾’)，YrJu1、YrJu2、YrJu3、YrJu4(‘尤皮Ⅱ’)，YrKy1、YrKy2、YrKy、YrKy4(‘抗引655’)，Yr3b、Yr4b(‘Hybirid 46’)，Yr10、Yr24、Yr26(‘貴農(nóng)22’)載體品種上的毒性頻率為51.68%、41.61%、40.94%、30.20%、14.09%,是抗病育種時值得關注的抗性基因。

表5 149個小麥條銹菌樣品的毒性基因及毒性頻率

2.5 小麥條銹菌毒性多樣性分析

2.5.1小麥條銹菌毒性多樣性

對伊犁州2020年小麥條銹菌群體毒性多樣性參數(shù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)(表6),在物種水平上,多態(tài)性位點數(shù)為17個,多態(tài)性位點占比89.47%;Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)為0.34;Shannon 信息指數(shù)為 0.50;表明整體多態(tài)性水平較高。在群體水平上,等位基因數(shù)為1.79～1.89;有效等位基因數(shù)分布于 1.57～1.64;Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)為 0.32～0.34,平均 0.33;Shannon 信息指數(shù)為 0.47～0.49,平均0.48;多態(tài)性位點數(shù)為 15～17,平均為 16;多態(tài)性位點占比 78.95%～89.47%,平均 84.21%。由Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)可知,伊犁州4縣條銹菌毒性多樣性水平差異不顯著。

表6 2020年伊犁州小麥條銹菌群體毒性多樣性指數(shù)1)

2.5.2小麥條銹菌不同群體間遺傳相似性分析

由表7可知,2020年伊寧縣和鞏留縣小麥條銹菌的Nei’s遺傳一致度(GI=0.992 5)及遺傳距離(GD=0.007 5)最近。在群體水平上,2020年伊犁州小麥條銹菌的遺傳距離為0.007 5～0.078 9(<0.10),Nei’s 遺傳一致度為0.924 1～0.992 5(>0.90),表明4縣小麥條銹菌間的遺傳距離較近,群體毒性結構相似。

表7 2020年伊犁州小麥條銹菌4個群體間遺傳距離和Nei’s遺傳一致度1)

對伊犁州不同小麥條銹菌群體毒性相似性進行聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖1),2020年4個小麥條銹菌群體的毒性相似系數(shù)在0.92～1.00,說明整體毒性相似系數(shù)較高,毒性多態(tài)性不顯著,遺傳距離較近,毒性結構相似。當種群之間相似系數(shù)閾值為0.99時,伊寧和鞏留群體聚為一類,其毒性相似程度最高;在相似系數(shù)閾值為0.96時,察布查爾群體與其他群體聚在不同分支,表明其與其他各縣條銹菌毒性相似程度最低。

圖1 2020年伊犁州小麥條銹菌群體毒性聚類分析樹狀圖Fig.1 Virulence dendrogram of the Puccinia striiformis f.sp. tritici population in Yili prefecture in 2020

3 結論與討論

小麥條銹菌生理小種毒性變異是導致小麥品種抗銹性喪失的主要原因[12-13]。了解小麥條銹菌群體毒性結構,監(jiān)測生理小種毒性變異是預測小麥條銹病發(fā)生流行、小麥品種抗條銹壽命及抗病育種的重要前提,能為小麥條銹病的有效防治提供理論依據(jù)。王付平[14]的研究表明,新疆條銹菌群體遺傳多樣性豐富,不同地域群體不存在遺傳分化,相似度較高。在新疆沒有監(jiān)測到貴農(nóng)22類群的生理小種。李偉華等[15]的研究表明,伊犁河谷地區(qū)小麥條銹菌主要致病類群為Hybrid 46類群、水源11類群、貴農(nóng)22類群,出現(xiàn)頻率分別為31.25%、22.92%和18.75%,但其樣品均采自新源縣,具有地緣局限性。賈秋珍等[16]2017年至2018年對采自甘肅省不同生態(tài)區(qū)的572份小麥條銹菌樣品進行生理小種鑒定及監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)主要致病類群為貴農(nóng)22類群,主要流行小種為CYR 34生理小種,且出現(xiàn)頻率穩(wěn)定;而本研究結果顯示,在新疆,貴農(nóng)22類群出現(xiàn)頻率為14.09%,CYR 34生理小種出現(xiàn)頻率為7.38%,這兩個類群(小種)在新疆雖不占主導地位,但出現(xiàn)頻率逐步提升,表明相對于甘肅而言,新疆小麥條銹菌毒性變異速率較慢,可能與新疆推廣的小麥品種抗性或者新疆條銹菌有性生殖階段的作用或者地理隔離及氣候因素有關,需要進一步深入分析。

本研究采集的小麥條銹菌樣品分布于伊犁州4縣7地,主要致病類群為水源11類群、Hybrid 46類群和貴農(nóng)22類群,出現(xiàn)頻率分別為44.30%、18.12%和14.09%。伊犁州小麥條銹菌毒性多態(tài)性較為豐富,在物種水平上多態(tài)性位點達17個,多態(tài)性位點百分率達89.47%;Nei’s遺傳多樣性指數(shù)及Shannon信息指數(shù)說明伊犁州小麥條銹菌群體毒性多樣性水平較高,群體間毒性相似系數(shù)較高。

各群體間的地理距離與其毒性多態(tài)性并無顯著相關性。例如,伊寧縣與鞏留縣相距較遠,但是聚類圖顯示兩地小麥條銹菌的毒性結構相同;伊寧縣與察布查爾縣地理位置相鄰,但二者毒性結構并不相似?？赡苁懿杉瘶颖玖考皹狱c的地理環(huán)境、小麥品種布局、種植面積的影響,也可能受到小麥條銹菌自身的寄生適合度的影響。本研究只針對伊犁州部分縣市的小麥條銹菌生理小種進行了詳細鑒定,采樣范圍仍相對局限,在以后的研究中應擴大取樣范圍并形成持續(xù)動態(tài)的監(jiān)測。