七葉樹種質資源調查和表型性狀多樣性分析

李玉嶺，張元帥，董愛輝，劉翠蘭，董元夫，付茵茵，毛秀紅★

（1.山東省林業(yè)科學研究院，山東 濟南 250014；2.費縣國有大青山林場，山東 費縣 273400；3.山東綠美生態(tài)環(huán)境工程集團有限公司，山東 濰坊 261300）

七葉樹（Aesculus chinensis）又名娑羅樹、猴板栗、開心果，屬七葉樹科（Hippocastanaceae）七葉樹屬（Aesculus）。落葉喬木，樹干高大，樹皮深褐色或灰褐色，小葉5~7片，長圓狀披針形或長圓狀倒披針形，花序軸被微柔毛，小花序具5~10花，種子近球形。其產(chǎn)于河南北部，河北、山西、陜西的南部，僅陜西秦嶺有野生分布[1]。七葉樹為世界著名四大行道樹之一，具有重要的觀賞、經(jīng)濟及藥用價值，如七葉樹是制作家具、各種雕刻工藝品的優(yōu)質木材，葉芽可代茶飲，皮、根可制肥皂，葉和花可做染料，種子可堿水煮后食用、提取淀粉和榨油[2]。其種子含有七葉皂苷[3]，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抑制胃酸分泌，抗水腫，清除活性氧，抗肝損傷[4]等，臨床上主要應用于慢性靜脈功能不全、腦水腫、四肢創(chuàng)傷及其手術后腫脹的治療，抗腫瘤[5-7]。自然狀態(tài)下七葉樹多與樟科（Lauraceae）、山毛櫸科（Fagaceae）、山茶科（Theaceae）等植物混生，常被當做一般雜木砍伐利用，如天然分布地在四川省境內的七葉樹受到嚴重破壞，資源蘊藏量逐年減少[8]。

林木種質資源在森林資源中占據(jù)核心地位，是維持生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的重要保障，是實現(xiàn)種質創(chuàng)新的重要基礎材料。從廣義上講，它是林木遺傳資源或基因資源，狹義上指的是林木品種選育和種苗生產(chǎn)的遺傳資源，是育種和種苗生產(chǎn)的重要來源[9]。而七葉樹古樹，具有極高的觀賞和文化價值，是非常珍貴的種質資源。目前七葉樹的研究主要在生殖生物學[10-11]、引種試驗[12-13]、栽培繁育[14-15]、造林技術[16]、種子化學成分和藥理作用[4,17-18]等方面。種質資源搜集、保存和遺傳多樣性評價鮮有報道，而遺傳多樣性是種內個體間變異的總和，直接影響到優(yōu)異基因能否被挖掘和利用。遺傳多樣性評價的方法主要有形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記和分子標記，形態(tài)學標記是種質資源遺傳多樣性最直接和最基本的方法。盡管分子標記在遺傳多樣性評價和品種特異性鑒定上應用較多，但由于分子標記與形態(tài)學性狀之間還不具備足夠的相關性，暫時無法取代形態(tài)學性狀評價[19-20]。本課題組實地走訪河南、陜西、甘肅、湖北的11個市縣（區(qū)），調查、收集七葉樹古樹種質資源14份，對其形態(tài)性狀進行遺傳多樣性、相關性、主成分和聚類分析，以期為優(yōu)異七葉樹種質的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調查點的確定

通過查閱各地植物志、文獻資料，搜索網(wǎng)絡信息，結合前期研究工作以及詢問各地林業(yè)部門人員，明確了七葉樹古樹的主要分布區(qū)域，據(jù)此制定此次的調查范圍。調查地區(qū)有河南省洛陽市欒川縣、洛陽市嵩縣、濟源市、南陽市方城縣、登封市，湖北省神農架林區(qū)，甘肅省隴南市康縣，陜西省西安市長安區(qū)、寶雞市鳳縣、銅川市宜君縣、漢中市略陽縣等4省的11個市（縣/區(qū)）。

1.2 調查方法和性狀測定

根據(jù)調查點，確定調查線路，采取實地踏查的方法尋訪七葉樹古樹生長的地點，進行生境觀察和記錄，拍攝樹木照片，用GPS對經(jīng)緯度和海拔進行定位記錄，用光學測高器測量樹高（精確到0.10 m），用卷尺測量胸徑（精確到0.01 m）、用米尺測量樹冠冠幅（東西長和南北長的平均值，精確到0.10 m）。采集果實、葉片供后期實驗室研究使用。調查結束后用游標卡尺分別對30個果實、種子進行長、寬、厚的測量，精確到0.01 cm。將10個果實破皮后疊加，用游標卡尺測量果皮厚度，測量3組求平均值，精確到0.01 cm。用電子天平稱量10個果實和種子重量，稱3組求平均值，精確到0.01 g。采集的七葉樹種子經(jīng)室外沙藏后，播種到苗圃中，用稻草蓋住，出苗后統(tǒng)計出苗率，出苗一個月后用米尺測量苗高，精確到0.01 cm。

1.3 數(shù)據(jù)整理

利用Excel 2017對七葉樹分布地點、測量的表型性狀統(tǒng)計分析，并進行標準差、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）、遺傳多樣性（采用Shannon-Wiener′s多樣性指數(shù)（H′），計算公式為H′=－∑Pi×lnPi，Pi=ni/N）的計算[21]。用SPSS20.0進行多重比較、相關性系數(shù)、主成分以及系統(tǒng)聚類（聚類采用Ward離差平方和法）。

2 結果與分析

2.1 七葉樹表型性狀遺傳多樣性及相關性分析

本次調查的樣點包括河南的2市3縣、湖北的1區(qū)、甘肅的1縣、陜西的1市3縣，其經(jīng)緯度范圍31.76°-35.55° N，105.42°-112.97° E間，海拔從134 m到1 607 m。樹高變幅9.60~32.00 m，平均20.90 m，變異系數(shù)34.89%，遺傳多樣性系數(shù)2.58。胸徑0.75~2.85 m，平均1.41 m，變異系數(shù)45.83%，遺傳多樣性系數(shù)2.55。樹冠冠幅12.20~30.30 m，平均19.34 m，變異系數(shù)28.08%，遺傳多樣性系數(shù)2.60（表1和表4）?？傮w來看，七葉樹14個形態(tài)性狀的變異系數(shù)范圍為13.42%~45.83%，平均為24.27%，其中胸徑、樹高、單種重、單果重變異系數(shù)較大（表4）。遺傳多樣性指數(shù)2.33~2.60，平均2.41，以樹冠冠幅（2.60）和樹高（2.58）最大。

表1 七葉樹種質資源調查情況Tab.1 Investigation list of germplasm resources of A.chinensis

不同地方七葉樹果皮和種皮的顏色基本一致，如果皮為棕米黃，種皮為黑紅色。果皮除了1號和2號開裂（為了簡潔方便，分析結果中地點用表中編號表示），其他地方果皮均不開裂（表2）。果皮厚度變幅為0.16~0.26 cm，平均0.21 cm，變異系數(shù)21.59%。單果重變幅9.68 g（11號）~32.03 g（1號），平均22.07 g，變異系數(shù)33%。單種重變幅5.90 g（3號）~25.76 g（1號），平均16.63 g，變異系數(shù)37.50%（表2和表4），可以得出1號的種子和果實質量均最大。種果比（種子重/果實重）可以反映種子的比重，3號種果比值最小，說明其種子比重最小。七葉樹上述形態(tài)特征與地理位置的相關性表明：樹高和緯度呈顯著負相關，單種重和單果重呈極顯著正相關（表3）。在調查走訪中，發(fā)現(xiàn)有些地方的七葉樹古樹由于生長在景區(qū)和寺廟而被保護起來，有些樹生長在高山或郊外而沒有被保護。

表2 七葉樹果實和種子的形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of A.chinensis fruits and seeds

表3 七葉樹形態(tài)特征與地理位置間的相關性分析Tab.3 Analysis of the correlation between morphological characteristics and geographical location of A.chinensis

表4 七葉樹14個性狀的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of 14 characters in A.chinensis

2.2 七葉樹種實性狀多重比較及相關性分析

通過七葉樹果實和種子性狀的多重比較（表5），可以總結出，在果實特征（果實長，果實寬，果實厚）中3號和8號差異均不顯著，顯然這兩個地方距離較遠，但果實特征極為相近，說明果實表型差異性與地理位置間無相關性。種子特性（種子長、種子寬、種子厚、種臍長、種臍寬）方面，1號和2號差異均不顯著，這與其二者位于同一個縣，地理距離較近有關。

為分析果實和種子性狀間的相關性，對其進行了相關性分析。一般而言，相關系數(shù)越大，相關性越強，相關系數(shù)越接近1（正相關）或-1（負相關），相關度越強，反之相關系數(shù)越接近于0，相關度越弱。研究發(fā)現(xiàn)，Pearson相關系數(shù)的絕對值在0.80以上，兩者關聯(lián)強度為極強相關，0.60~0.80為強相關，0.40~0.60為中等程度相關，0.20~0.40為弱相關，0.20以下為極弱相關或無相關[22]。表6中可以看出果實長與果實寬，種子寬分別與果實厚、種子長、種臍長，種子厚和種臍寬均為極顯著性強正相關。果實厚和種子長、種臍長，種子長和種臍長為極顯著中等程度正相關。

表6 七葉樹果實和種子性狀相關性分析Tab.6 Pearson coefficient correlation analysis of fruit and seed characters of A.chinensis

2.3 七葉樹種實性狀主成分和聚類分析

主成分分析是利用降維的思想把多個性狀指標綜合轉化成少數(shù)幾項指標進而獲得最主要信息，是對多因素復雜問題進行簡化分析的方法。對11份七葉樹的8個種實性狀標準化后進行主成分分析（表7），得到的前3個主成分，可以反映總信息量的75.91%，基本代表大部分原始性狀的變異信息。主成分1的特征值為3.19，貢獻率為39.85%，對應的特征向量與種子寬、種子長、種臍長、果實厚的關系密切，為高度相關因子。主成分2的特征值為1.82，貢獻率為22.78%，主要代表果實長、果實寬。主成分3的特征值為1.06，貢獻率為13.28%，主要代表種子厚和種臍寬。

表7 七葉樹11份種質資源8個種實性狀主成分分析Tab.7 Principal component analysis of eight seed traits in 11 germplasm resources of A.chinensis

根據(jù)種實表型性狀，按照系統(tǒng)聚類Ward法在歐式距離為5可以將七葉樹種質資源劃分為3大類群（圖1）。類群Ⅰ有5份材料，分別為1、2、4、9、10。這5份材料的某些種實性狀差異不顯著，其中果實寬（1、2、4、9）差異不顯著，種子寬（1、2、4、10）差異不顯著，種子厚（1、2、9、10）差異不顯著（表5）。類群Ⅱ有4份材料，為3、6、8、11，這4份材料的果實厚性狀差異不顯著，種子長和種臍寬方面（3、6、11）差異不顯著，種臍長（3、6、8）差異不顯著。類群Ⅲ有2份材料，為5和7，這2份材料的果實長和種子長差異不顯著。系統(tǒng)聚類說明以上材料是按照果實和種子性狀差異程度進行聚類，而并不是嚴格按照地域聚類。

圖1 七葉樹種質資源聚類分析（編號與表2同）Fig.1 Cluster analysis of A.chinensis germplasm resources(The numbers were the same as in Tab.2)

表5 七葉樹果實和種子性狀多重比較Tab.5 Multiple comparison of fruit and seed characters of A.chinensis

2.4 七葉樹種子出苗情況

表8中可以看出，11個地方的七葉樹種子共有10個出苗（5號由于儲藏不當，種子霉爛）。七葉樹種子出苗率范圍為12.25%~66.67%，出苗率最高的為8號（66.67%），其次為1號（54.76%）和2號（48.89%）。出苗后一個月測量苗高，得出2號的苗最高(19.22 cm)，6號苗最矮(10.00 cm)。

表8 七葉樹種子出苗率和苗高Tab.8 The ratio of seedling emergence and seeding height of A.chinensis

3 結論與討論

植物的表型性狀是由基因和環(huán)境條件共同決定的，表型多樣性的分析是物種遺傳多樣性評價最直接的方法，而遺傳多樣性的評價對優(yōu)異種質資源的挖掘和創(chuàng)新利用具有重要意義。胡光明等對野生獼猴桃（Actinidia）果實的15個性狀進行遺傳多樣性分析，得出變異系數(shù)在24.66%~75.76%，遺傳多樣性指數(shù)0.35~2.02，表明獼猴桃種質的性狀變異類型豐富，表型遺傳多樣性高[23]。廣西食用木薯(Manihot esculenta)也存在一定的遺傳多樣性，48份木薯種質資源的表型性狀平均變異系數(shù)為37.90%，平均遺傳多樣性遺傳指數(shù)約為0.81[24]。同樣，云南茶樹（Camellia sinensis）14個數(shù)量性狀的變異系數(shù)在10.27%~48.14%，13個質量性狀遺傳多樣性指數(shù)在0.64~1.40[25]，具有豐富的表型遺傳多樣性。楸樹(Catalpa bungei)葉部性狀及皮孔密度的變異系數(shù)在8.57%~26.91%，遺傳多樣性指數(shù)1.80~1.94，具有較大變異，多樣性豐富且分布均勻[26]。本研究的14份七葉樹古樹種質資源表型性狀差異較大，變異系數(shù)范圍為13.42%~45.83%，其中以胸徑、樹高、單種重、單果重的變異最大，變異系數(shù)分別為45.83%、34.89%、37.50%和33.00%，說明這些性狀的離散程度大，變異較豐富。遺傳多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù))可直觀反映某性狀的出現(xiàn)頻率和分布狀況，暗示其豐富程度[27]。七葉樹14個性狀的遺傳多樣性指數(shù)2.33~2.60，平均2.41，這說明七葉樹種內有較大的遺傳差異，表型多樣性豐富，可為良種選育提供充足的遺傳資源。

七葉樹形態(tài)特征與地理位置的相關性得出，樹高和緯度為顯著負相關。植物表型性狀的地理變異規(guī)律也有過報道，如構樹（Broussonetia papyrifera）的種子長和種子厚受到經(jīng)度的影響大于緯度，其與采種點的海拔呈正相關[28]。七葉樹種實性狀的相關性表明，果實長與果實寬，種子寬分別與果實厚、種子長、種臍長，種子厚與種臍寬均為強正相關性。而青檀（Pteroceltis tatarinowii）的種子長與種子寬為中相關性，果實寬與種子寬、種子厚為弱相關性，種子寬與種子厚為弱相關性[29]。主成分分析將七葉樹種實8個數(shù)量性狀轉化為能代表75.91%信息的3個主成分，各主成分載荷量反應了主要數(shù)量性狀的育種選擇潛力。不同地方的七葉樹果實和種子性狀比較發(fā)現(xiàn)，有些雖然生長地不同，但果實和種子某些性狀差異并不顯著，并且系統(tǒng)聚類也是按照果實和種子的差異進行聚類，而并不是嚴格按照地域聚類，這種情況同樣也出現(xiàn)在青檀、山桐子（Idesia polycarpa）、陜西古茶樹中[29-31]。育苗試驗表明11個地方的七葉樹種子，有10個地方的種子出苗，出苗率為12.25%~66.67%，得出不同地方種子出苗率差異較大。七葉樹種子出苗率差異較大的原因除了種源地有關外，還與種子含水量、空氣濕度有關，一方面七葉樹種子容易脫水失活，自然放置10 d左右，一半以上的種子失活[32]。另一方面遇到連續(xù)陰天空氣濕度大容易發(fā)霉，如本試驗中河南濟源（5號）的七葉樹種子就因陰雨天發(fā)霉而腐爛。本研究對七葉樹種實性狀進行相關性、主成分和聚類分析，下一步將對七葉樹種質資源表型性狀進行全面綜合評價。