基于低場核磁共振技術(shù)快速測定油茶籽含油率

孔凡利，付宇新，王召瀅，曹 冰,3，賀義昌，曾凡新，雷小林

（1.國家林業(yè)和草原局林草調(diào)查規(guī)劃院，北京 100714；2.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330013；3.江西農(nóng)業(yè)大學林學院·江西省森林培育重點實驗室，江西 南昌 330045）

油茶（Camellia oleifera）屬山茶科山茶屬植物，廣泛種植于我國17個?。▍^(qū)）1 100多個縣（市）,是我國重要的木本油料植物[1]。油茶的主要產(chǎn)品茶油——油茶種子榨出的油，是一種天然的優(yōu)質(zhì)保健食用油，與棕櫚油、橄欖油和椰子油并稱為世界四大木本植物油[2]。茶油的成分主要包括脂肪酸、維生素、山茶苷和茶多酚等，其中脂肪酸含量約為99%，主要包括油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸，棕櫚酸、花生酸等飽和脂肪酸[3]。茶油的用途非常廣泛，據(jù)報道，茶油具有預(yù)防心血管疾病、減少血液中的膽固醇、加強免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤、抗炎等多種作用[4-5]。

目前，測定植物種子含油率的方法有比重法[6]、折光法[7-8]、索氏提取法[9-11]、核磁共振法[12-14]、近紅外光譜法[15-17]等。索氏提取法是一種傳統(tǒng)的含油率測定方法，也是目前GB/T 14488.1-2008《植物油料含油量測定》采用的測試方法，該方法主要通過提取種子中的油脂成分，然后稱取殘渣質(zhì)量計算種子的含油率。索氏提取法普遍應(yīng)用于常見的植物和食品的脂肪測定。盡管其精確度較高，但測定過程繁瑣，提取時間長，一般達到了10 h以上；提取后抽提瓶不易恒重，待測的油料樣品要進行充分粉碎。該方法還需要使用一定量低熔點易揮發(fā)有機試劑，如石油醚、乙醚、正己烷等，提取過程消耗大量的水、電。且實驗誤差大，效率低，綜合成本高。因此，簡便快捷、無毒無損、準確可靠的檢測技術(shù)是提高油料植物種子含油率測定效率和加速植物良種選育的重要途徑。

低場核磁共振技術(shù)（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是一種快速、無損的油料植物種子含油率檢測技術(shù)，在恒定磁場與交變磁場的作用下，1H、13C、31P、19F、15N、129Xe等具有固定磁矩的原子核，發(fā)生原子核的共振躍遷，與交變磁場發(fā)生能量交換的現(xiàn)象。其中，1H以其自然界中豐度高、核磁共振信號強、易于檢測、便于觀察、存在穩(wěn)定等特點使1H NMR技術(shù)成為了目前應(yīng)用最多的核磁共振技術(shù)。核磁共振法是通過檢測樣品中氫質(zhì)子含量來計算樣品的含油率，且其測試過程簡便、快捷、無損、準確。在小籽粒類經(jīng)濟油料作物方面已有大量應(yīng)用，但是在油茶、核桃等植物含油率檢測方面少有報道。蔡堅等[18]用兩種方法測定10份高州油茶種仁含油率，結(jié)果絕對偏差均小于2%，具有較好的對照性。劉喻娟等[19]用核磁共振法測定廣寧紅花油茶種仁含油率，得出該方法精密度高，穩(wěn)定性好。

本研究采用NMI20低場核磁共振儀測定油茶干籽含油率，并與索氏提取法進行比較，旨在為油茶等油料植物種子含油率的快速測定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：油茶籽樣品采自江西省林業(yè)科學院油茶基地；定標茶油來源于茶油生產(chǎn)企業(yè)。

試劑材料：石油醚（60℃~90℃）（上海國藥集團化學試劑有限公司）分析純，實驗超純水（默克化工技術(shù)有限公司）。

儀器設(shè)備：NMI20低場核磁共振分析儀（蘇州紐邁分析儀器股份有限公司），ME104E電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司），電熱鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），HH-S6電熱恒溫水浴鍋（金壇市恒豐儀器），SXT-06索氏提取器（四川蜀玻（集團）有限責任公司），高速粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），干燥器、冷凝管、濾紙筒和脫脂棉等。

1.2 試驗方法

1.2.1 索氏提取法測定油茶籽含油率

稱取粉碎好的均勻試樣約5 g移入到濾紙筒中，將濾紙筒放入提取管內(nèi)，連接冷凝管和圓底燒瓶，加入100 mL石油醚至圓底燒瓶中，在85℃水浴鍋中加熱回流6~8 h；隨后取出濾紙筒，取下圓底燒瓶，回收石油醚；最后，將圓底燒瓶在100~105℃烘箱中烘干2 h，直至前后兩次重量不超過0.0010 g為止，通過茶油質(zhì)量計算含油率。

1.2.2 油茶籽油和水分定標

（1）油茶籽油定標曲線

稱取純茶油約50 g，放入溫度設(shè)定為105℃的鼓風干燥箱內(nèi)1.5 h，然后冷卻至室溫，備用。

根據(jù)油茶籽含油量預(yù)估茶油定標曲線范圍，分別稱量茶油3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.5 g并分別倒入專用定標測定管內(nèi)（茶油質(zhì)量梯度視油茶籽含油量而定），測定信號，定標。

（2）水分定標曲線

分別稱量1 %（m/v）氯化錳溶液1.0 g，0.8 g，0.6 g，0.4 g，0.2 g，0.1 g，并分別倒入專用定標測定管內(nèi)，測定信號，定標。

1.2.3 核磁共振法測定油茶籽含油率

稱取油茶干籽樣品約100 g，放入溫度設(shè)置為105℃的烘箱干燥，直至樣品含水率在10%以下，冷卻至室溫，隨機稱取4~8 g（精確到0.001 g）樣品（樣品量視樣品籽粒大小而定），裝入測定專用試管中，置于儀器測試區(qū)域，調(diào)用標準曲線，測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽油和水分定標曲線

通過連續(xù)2 d油茶籽油標準曲線和水分標準曲線測定，曲線擬合度均滿足試驗要求，具體見圖1、圖2和表1、表2。

表1 兩次定標的油茶籽油含油率標準曲線Tab.1 Calibration curve of oil content of camellia seed oil

表2 兩次定標的水分標準曲線Tab.2 Calibration curve of moisture

圖1 油茶籽油含油率定標標準曲線Fig.1 Calibration curve of oil content of C.oletfera seed oil

圖2 水分定標標準曲線Fig.2 Calibration curve of moisture

從油茶籽油和水分定標曲線結(jié)果來看，分別在不同日期測得的曲線擬合情況十分相近，油茶籽油兩次擬合相關(guān)系數(shù)分別達到0.9998和0.9997，而水分擬合相關(guān)系數(shù)也達到了0.9998和0.9999，均達到0.999以上，符合測定要求。信號質(zhì)量比數(shù)據(jù)方面，油茶籽油兩次的最大信號質(zhì)量比分別為1 460.346和1 451.531，水分兩次的最大信號質(zhì)量比分別為781.587和787.109，兩者均十分接近，重現(xiàn)性較好。結(jié)合標準曲線的擬合相關(guān)系數(shù)以及核磁共振反饋的信號質(zhì)量比數(shù)據(jù)比較分析，油茶籽油和水分定標曲線表現(xiàn)穩(wěn)定，可重復(fù)性好，可以作為油茶籽含油率和水分測定使用。

2.2 索氏抽提法和核磁共振法的比較

取30份油茶籽樣品，在105℃下烘干（含水率≤10%），冷卻備用。每份樣品先用核磁共振法測定含油率，再按照索氏提取法測定同一份樣品，測定結(jié)果及偏差分析情況如圖3、表3所示。

圖3 30份油茶籽樣品索氏提取法和核磁共振法測定含油率結(jié)果比較Fig.3 Comparison between SEM and NMR determination of oil content of 30 samples of C.oleifera seeds

由圖3可知，30份樣品2種方法含油率測定結(jié)果均十分接近，說明采用核磁共振法在一致的條件下測定含油率結(jié)果準確、可靠。表3的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，30份樣品2種方法之間的絕對偏差范圍為0.02%~1.53%，均小于2%，相對偏差范圍為0.07%~4.97%，均小于5%，由此可知兩種方法具有較好的對照性。其中核磁共振法測定的油茶籽含油率結(jié)果大多數(shù)高于索氏提取法，可能的原因是核磁共振法測定的油茶籽含油量是包含其中脂肪酸和醇類等物質(zhì)的氫質(zhì)子信號總量，而索氏提取法無法將油脂樣品中的脂肪酸和醇類等物質(zhì)完全抽提出來。另外樣品可能存在流動性的自由水氫質(zhì)子對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。

表3 30份油茶籽樣品索氏提取法和核磁共振法測定含油率結(jié)果對比Tab.3 Results of SEM and NMR determination of oil content of 30 samples of C.oleifera seeds

從兩種方法的測定效率方面來看，傳統(tǒng)索氏提取法測定含油率包含樣品制備、回流提取、油脂回收濃縮干燥等過程，一般需要8~10 h，而使用核磁共振法可將單個樣品測定時間縮短至5 min，測定效率大大提高，而且準確度高，非常適合進行大批量樣品含油率的測定。

2.3 精密度檢驗

取油茶籽樣品20份，采用低場核磁共振含油含水率分析軟件測定樣品含油率，每份樣品重復(fù)測定7次，測定結(jié)果見表4，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，20份油茶籽樣品含油率結(jié)果標準偏差范圍為0.10%~0.24%，均小于0.3%，變異系數(shù)范圍為0.34%~0.91%，表明核磁共振法測定油茶籽含油率具有很好的精密度。

表4 20份油茶籽樣品含油率重復(fù)7次測定結(jié)果Tab.4 Oil content of 20 samples repeated 7 times

2.4 穩(wěn)定性檢驗

取油茶籽樣品20份，采用低場核磁共振含油含水率分析軟件測定樣品含油率，每份樣品稱取7個不同質(zhì)量（5.0~7.0 g）進行測定，測定結(jié)果見表5。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，20份油茶籽樣品7次測定的含油率變化范圍小，測定結(jié)果較穩(wěn)定。20份樣品含油率結(jié)果標準偏差范圍為0.58%~2.43%，均小于3%，變異系數(shù)范圍為1.47%~9.14%，均在10%以內(nèi)，表明核磁共振法測定油茶籽含油率的重現(xiàn)性好。

表5 20份油茶籽樣品7次稱量含油率測定結(jié)果Tab.5 Determination results of oil content of 20 samples after 7 times weighing

3 結(jié)論與討論

核磁共振法測定含水率、含油率所依據(jù)的是樣品中所含氫質(zhì)子總量，通過油水的橫向弛豫時間差，進行反演預(yù)測，而樣品中水分過多則會導致水的橫向弛豫時間接近于油，在反演過程中造成結(jié)果偏差。有研究表明核磁共振法測定樣品含油率隨水分含量的增加而提高，增加一定體積的水，樣品中的氫質(zhì)子含量相應(yīng)增加，導致儀器測定結(jié)果也相應(yīng)增大[18-20]。因此，測定時要嚴格控制樣品中的含水量，樣品必須干燥至含水率低于10%，降低過多的水分對測定結(jié)果的干擾。另外樣品合理的測定質(zhì)量范圍在5.0~7.0 g之間，測定結(jié)果準確。

傳統(tǒng)的索氏抽提法測定過程耗時長、操作繁瑣、有機試劑和易耗品多、水電消耗大、測定效率低、人力成本高，還存在一定的實驗安全隱患，而核磁共振法簡便快速、無毒無損、準確可靠，本研究對核磁共振法和索氏提取法測定油茶籽含油率進行比較，核磁共振法不同時間定標油茶籽油和水分標準曲線的擬合相關(guān)系數(shù)均大于0.999，核磁共振信號響應(yīng)值相近，油茶籽油和水分定標曲線表現(xiàn)穩(wěn)定，可重復(fù)性好。兩種方法測定的20份樣品含油率結(jié)果比較，測定結(jié)果絕對偏差均小2%，平均相對偏差均小3%，表明核磁共振法測定結(jié)果準確可靠。從核磁共振測定方法的精密度和穩(wěn)定性檢驗結(jié)果來看，核磁共振法測定油茶籽含油率的精密度高，穩(wěn)定性好。因此，核磁共振法可作為一種快速、無損、準確測定油茶籽含油率的方法。