機械修剪疏果提升椪柑果實品質的作用及機制

石瑩，曾譯可，陳思怡，李國敬，黃先彪，李善軍，李春龍，謝宗周，劉繼紅

1.華中農(nóng)業(yè)大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省當陽市特產(chǎn)技術推廣中心，當陽 444100；3.華中農(nóng)業(yè)大學工學院，武漢 430070；4.湖南省邵陽市農(nóng)業(yè)科學院，邵陽422002

柑橘是我國南方最重要的經(jīng)濟作物，柑橘果實不僅可以鮮食，還是重要的藥用和食品工業(yè)原料，在國際農(nóng)產(chǎn)品貿易中具有不可忽視的地位。隨著消費水平的提高，生產(chǎn)優(yōu)質大果成為栽培過程中的重要目標，而常規(guī)管理的果園一般花量大、樹體養(yǎng)分消耗多，通過人為調節(jié)進行高效的花果管理才能連年優(yōu)質穩(wěn)產(chǎn)。美國早在20 世紀70 年代開始研究柑橘的化學疏花疏果［1］，我國生產(chǎn)實踐中主要采用人工疏果。張長梅［2］認為中國柑橘產(chǎn)業(yè)獨特的競爭優(yōu)勢就是生產(chǎn)成本低，但隨著農(nóng)村勞動力外流和老齡化加劇，柑橘生產(chǎn)普遍出現(xiàn)用工成本上升、果園管理不到位等現(xiàn)象［3］，人工疏果不再適應當前勞動力短缺的現(xiàn)狀［4］。我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)逐漸開始進入以機械生產(chǎn)為主的時代［5］，王劉坤等［6］建議我國柑橘產(chǎn)業(yè)要結合當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展情況加大果園機械化技術的研發(fā)和推廣力度，率先在勞動密集環(huán)節(jié)實現(xiàn)突破，提高生產(chǎn)效率。柑橘機械修剪在國外應用較多，利用整株幾何修剪機、單枝修剪機［7］對樹體枝梢進行整理，從而調控樹體高度、促進內膛進光。

湖北省是我國主要的柑橘優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一，椪柑因其易剝皮、果肉脆等特點成為重要發(fā)展的寬皮橘類型。但受經(jīng)濟發(fā)展狀況、產(chǎn)業(yè)布局合理性以及地理條件的限制，我國柑橘面積和產(chǎn)量連續(xù)增加的同時生產(chǎn)效率沒有得到相應提升［6］。椪柑產(chǎn)業(yè)發(fā)展遇到的瓶頸問題是坐果量大導致果實小和品質參差不齊，因此，增加大果比例和提升果實品質是促進椪柑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要手段。然而，利用機械修剪進行柑橘疏果尚無報道，機械修剪能否實現(xiàn)疏果和提質、對產(chǎn)量和果實品質的影響有待驗證，修剪方案也有待進一步優(yōu)化和提升。鑒于此，本研究以‘鄂柑1號’椪柑植株為試材，利用華中農(nóng)業(yè)大學工學院研發(fā)的背負式修枝機進行機械修剪疏果，探究機械修剪疏果處理后果實品質的變化，并基于糖酸代謝基因表達分析初步揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

供試植物為湖北省當陽市半月鎮(zhèn)龍臺村鳳凰山18 年生‘鄂柑1 號’椪柑（砧木為枳（Poncirus trifoliata）），樹勢中庸，樹冠高度2.5 m，株距2.5 m，行距4.5 m，果園進行常規(guī)肥水管理和病蟲害防治。

椪柑第2 次 生理落果結束后，2020 年7 月19 日（開花后88 d）進行機械修剪疏果。試驗設2 個處理（每個處理各選3 行樹）：處理1（機械修剪疏果，簡稱為MT）以行間方向與樹冠滴水線的切點為起點，使用背負式修剪機將該切點往樹干方向50 cm 內的所有枝條與果實一同疏除；處理2 不疏果，作為對照（CK）。修剪后，每個處理隨機選3 棵樹，每棵樹隨機選擇15 個果實進行掛牌標記，每15 d 測量1 次果實橫徑和縱徑；10 月7 日開始每15 d 采樣1 次，在每棵植株同一高度上的4 個方向各隨機采1 個果實，采樣當天帶回實驗室測定生理指標，并分別取下囊瓣和果皮用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱備用。12月25 日果實采收后對2 個處理的果實分別稱質量、計算產(chǎn)量并統(tǒng)計采果數(shù)，所有時期取樣完成后分析可溶性糖和有機酸含量，并分析糖酸代謝相關基因的表達水平。

1.2 測定項目與方法

1）果實大小及產(chǎn)量測定、外觀品質分析。使用電子游標卡尺（精確到0.01 mm）測量果實橫縱徑；使用電子天平（精確到0.01 g）測定單果質量；使用電子測厚規(guī)測量果皮厚度；使用色彩色差儀（*cm-5，美能達，Japan）測量果面色澤參數(shù)L*、a*和b*；使用質構儀（*TA.XT.Plus，Stable micro systems，UK）測定硬度；使用機械分選線分級，對2 個處理的所有果實稱質量、計算產(chǎn)量，并統(tǒng)計采果數(shù)。

2）可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和有機酸含量分析?？扇苄怨绦挝锸褂肞A?-1 手持折光測糖儀（Atago，Japan）測定；可滴定酸使用GMK-835F 水果酸度計（G-WON，South Korea）測定。采用氣相色譜法［8］測定可溶性糖和有機酸含量，使用安捷倫GC-7890B 氣相色譜儀，HP-5 色譜柱（5%-Phenyl-methyl polysiloxane.30 m×320 μm×0.25 μm），檢測器溫度300 ℃，載氣（N2）流量45 m?/min，燃氣（H2）流量40 m?/min，空氣流量450 m?/min。

3）總RNA 提取及熒光定量PCR。用P?ANT pure通用植物總RNA 快速提取試劑盒（Aidlab公司）提取椪柑果肉總RNA。用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）去除基因組DNA 后合成cDNA，實時熒光定量PCR 采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（ABI，USA）檢測基因表達量，方法參照說明書。采用QuantStudio 7 Flex system（Applied Biosystems，美國）熒光定量分析儀進行反應，基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法［9］計算。本研究用到的引物信息見表1。

表1 基因表達分析用的引物及序列Table 1 List of primers used for expression analyses of the genes in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 進行數(shù)據(jù)分析，采用?SD進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 機械修剪疏果對果實外觀品質的影響

花后88 d（7月19日）進行機械修剪疏果，疏果當天CK 的果實橫徑、果實縱徑與MT 處理組沒有顯著差異，處理15 d 后MT 顯著高于CK（圖1A、B），機械修剪疏果顯著增大了果實的橫徑和縱徑。機械修剪疏果80 d時（花后168 d）開始采樣測定單果質量和果實品質，CK 的單果質量平均值為93.62 g，而MT 的單果質量平均值達到了109.34 g，極顯著高于CK，花后247 d 果實采收時MT 的平均單果質量相對CK 提高了25.04%（圖1D）。果實硬度在成熟過程中逐漸降低，MT 的硬度高于CK 且自花后168 d 開始差異極顯著（圖1E），機械修剪疏果顯著提高了果實硬度。

在果皮著色方面，機械修剪疏果對果實的果皮色澤參數(shù)L*值沒有顯著影響（圖2 A）；花后206 d 時MT 的平均果皮色澤參數(shù)a*值超過了CK 且在220 d時表現(xiàn)出顯著差異，機械修剪疏果加快了果實的轉色過程（圖2 B）；果皮色澤參數(shù)b*值（黃藍值）的變化情況與L*相似，二者之間沒有顯著差異（圖2 C）；而在色澤飽和度方面，MT 的CCI（citrus color index）顯著低于CK 直到花后206 d，機械修剪疏果延緩了果實CCI 的增加但不影響最后的著色（圖2D）。

2.2 機械修剪疏果對果實內在品質的影響

椪柑果實可溶性固形物（total soluble solids，TSS）持續(xù)積累，花后191 d MT 的TSS 含量快速增加，花后206 d 開始顯著高于CK，花后220 d 達到了11.57%，極顯著高于CK的10.33%，二者之間保持顯著差異直至采收（圖3 A）?？傻味ㄋ幔╰itratable acids，TA）持續(xù)下降，CK 從2.19%降至0.6%，MT 從2.01%降至0.56%且各時期的平均值低于CK，花后206 d 差異顯著（圖3 B）。機械修剪疏果顯著提高了椪柑果實的可溶性固形物含量，也一定程度上降低了可滴定酸含量。

花后206 d時MT的蔗糖含量達到了50.63 mg/g，顯著高于CK 的39.62 mg/g，機械修剪疏果顯著提高了椪柑果實的蔗糖含量（圖4 A）；果糖的積累趨勢與葡萄糖相似，沒有受到機械修剪疏果的影響（圖4 B、C）；檸檬酸和奎寧酸的含量持續(xù)降低，機械修剪疏果顯著加快了檸檬酸和奎寧酸降解的速度（圖4 D、F）；花后168 d 至花后247 d 蘋果酸的含量稍有增加，花后206 d 開始MT 的蘋果酸含量顯著高于CK（圖4 E），機械修剪疏果提高了蘋果酸含量。

12月25日（花后247 d）采收果實，統(tǒng)計分析果實大小，發(fā)現(xiàn)機械修剪疏果處理組（MT）沒有果徑＜55 mm 的 果 實；55～60 mm 占 比2.81%，為CK 的6.59%；60～65 mm 占比12.39%，單株68 個，為CK的20.88%；65～70 mm 占比28.49%，單株156 個，為CK 的65.50%；70～75 mm 大果占比34.14%，單株187 個，為CK 的1.82 倍；＞75 mm 果實占比22.17%，單株122 個，為CK 的2.87 倍。測定12 月25 日采收果實的果皮厚度發(fā)現(xiàn)，MT 的平均果皮厚度為3.54 mm，與CK 的平均果皮厚度3.30 mm 沒有顯著差異，機械修剪疏果在不影響果皮厚度的情況下顯著提升了大果比例（表2）。

表2 機械修剪疏果對椪柑果實大小及產(chǎn)量的影響Table 2 The effect of mechanical pruning-mediated fruit thinning on the size and yield of Ponkan fruit

2.3 機械修剪疏果對糖酸代謝相關基因表達水平的影響

果實品質分析結果表明機械修剪疏果提高了椪柑果實的蔗糖含量和可溶性固形物含量，降低了檸檬酸含量和可滴定酸含量。因此，我們首先驗證MT和CK 果實中蔗糖代謝相關基因的表達水平。機械修剪疏果處理25 d 時CsSSs 在CK 中的表達水平顯著高于MT，但此后機械修剪疏果果實中CsSSs 的相對表達量快速升高，且在處理50 d 后顯著高于CK，其中CsSS4增加程度最高，高出同一時期CK 果實中表達水平的35 倍（圖5 A）；CsSPSs 的表達水平變化情況與CsSSs相似（圖5 B）。蔗糖合成相關基因的表達情況與MT 果實中蔗糖含量顯著高于CK 果實的結果相符，且MT 和CK 果實之間蔗糖含量表現(xiàn)出顯著差異的時期為花后206 d，而MT 果實中蔗糖合成相關基因顯著上調的時間為花后191 d 至花后220 d期間，二者之間的變化時間也一致，表明機械修剪疏果可能通過上調CsSSs 和CsSPSs，尤其是CsSS4、CsSPS1、CsSPS3和CsSPS4的表達提高了椪柑果實的蔗糖含量。

同樣，我們驗證了MT 和CK 果實中檸檬酸代謝相關基因的表達水平。檸檬酸降解相關基因中，機械修剪疏果處理50 d 后CsACLα2 的表達水平在MT中顯著升高而CsACLβ的表達水平顯著降低（圖6 A）；處理75 d 后，CsACO1在MT 中的相對表達量極顯著高于CK，CsACO2和CsACO3的表達水平在機械修剪疏果處理50 d 后極顯著高于CK（圖6 B）；機械修剪疏果50 d 后CsNADP-IDH2/3在MT 中的表達水平快速升高顯著高于CK，CsNADP-IDH1處理75 d 后在MT 果實中也顯著高于CK（圖6 C）。機械修剪顯著上調了椪柑果實中檸檬酸降解相關基因的表達水平，上調時間大多為機械修剪疏果后50 d 或者75 d，這與MT 果實中檸檬酸含量顯著低于CK 的結果相符，進一步證明了機械修剪疏果可能通過上調檸檬酸降解相關基因CsACOs 和CsNADP-IDHs，尤 其 是CsACO1、CsACO2和CsACO3以 及Cs-NADP-IDH1和CsNADP-IDH3的表達來降低椪柑果實中檸檬酸的含量。

3 討論

本研究中機械修剪疏果處理顯著提高了椪柑大果的分布頻率和平均橫徑、縱徑以及單果質量?？梢姍C械疏花疏果、化學疏花疏果［13］、人工疏果［14］均能減小無效的養(yǎng)分消耗，降低果實之間的營養(yǎng)競爭，從而提高大果比例、提升果實品質，并改善樹體的營養(yǎng)狀況。前人研究發(fā)現(xiàn)，果實增大的同時果皮一般也相應增厚［15］，而本研究中MT 果實的果皮厚度相較CK沒有顯著差異，表現(xiàn)出優(yōu)良的品質。

此外，機械修剪疏果還顯著提高了果皮硬度，在藍莓［16］、蘋果［17］、溫室油桃［18］中也得到了同樣的結果，果實硬度對運輸距離、貨架期和經(jīng)濟效益有非常大的影響。通常認為果實組織中維持較高的鈣水平可以保持果實的硬度，我們推測機械修剪疏果可能通過減小養(yǎng)分競爭來維持較高的鈣水平，從而提高果實硬度、提升果實在貯藏和銷售過程中的表現(xiàn)。在果皮色澤方面，機械修剪疏果加快了椪柑果實的著色，與鄧永輝等［14］在云南早熟柑橘上的研究結論一致，我們推測果面著色的加快與機械修剪疏果減少了養(yǎng)分競爭、改善了樹體光照、增加了果實的光合作用有關。此外，田夢瑤等［19］研究發(fā)現(xiàn)外源蔗糖處理可以通過維持相對較高的花色苷合成代謝相關酶的活性來促進桃果皮花色苷的合成，因此我們推測果皮著色的加快還可能受到蔗糖含量增加的影響。

本研究中機械修剪疏果提升了椪柑果實的內在品質，顯著提高了TSS 含量、促進了蔗糖的積累。果實糖分運輸和積累是一項復雜的過程。柑橘果實進入成熟期后糖分迅速積累［20］，機械修剪疏果通過減小養(yǎng)分競爭、改善樹體光照增加了葉片光合產(chǎn)物向果實中的分配量；機械修剪疏果能夠增強果實本身的光合作用，減少果皮對光合產(chǎn)物的競爭，直接或間接促進了汁囊中糖的積累；陳俊偉［21］提出蔗糖的運輸具有攜帶信號的功能，植物通過對不同糖水平的響應來調節(jié)相關基因表達，從而將各種外部的環(huán)境因子（光、其他養(yǎng)分、生物及非生物脅迫）和內在的發(fā)育進程整合在一起，我們發(fā)現(xiàn)MT 果實中蔗糖合成相關基因CsSS2、CsSS3和CsSS4以及CsSPS1、CsSPS3和CsSPS4的表達水平顯著上調。另外，糖對源庫關系也起調控作用，蔗糖含量的增加意味著更高的糖分積累基礎。

柑橘果實中的檸檬酸主要在汁胞細胞的線粒體中直接合成［22］，其含量受溫度、水分、營養(yǎng)元素、光照等環(huán)境因素或栽培措施的影響［23］，如增強光照可促進檸檬酸的降解、水分脅迫可顯著提高果實檸檬酸含量［24］。我們推測機械修剪疏果改善了光照條件，從而上調檸檬酸降解相關基因CsACLs、CsACOs 和CsNADP-IDHs 的表達水平，以此加快檸檬酸的降解，但果實感應環(huán)境信號、轉錄因子參與代謝途徑調控的具體機制還有待進一步研究。

本研究中，機械修剪疏果可以顯著提高椪柑的果實品質，但更重要的是在疏果效率和經(jīng)濟效益方面的提升。傳統(tǒng)的手工疏果效率約為2棵/h，而機械修剪疏果處理效率可達16棵/h，本研究供試果園700株椪柑若全部采用手工疏果需要350 h，而機械修剪疏果只需43.75 h，大大提升了疏果效率、節(jié)省了人工。總體來看，機械修剪疏果能夠在省時省力的前提下顯著提升椪柑的果實品質、改善樹體營養(yǎng)狀況，增加果農(nóng)的收益，可以在產(chǎn)區(qū)進行進一步的試驗和推廣。