乳鐵蛋白胃蛋白酶水解物分離純化抗菌肽的研究

張晨玥，郝剛*，蔡寅川，唐善虎，李思寧

(1.西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.四川阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所，四川 汶川 623000)

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是乳中非常重要的一種非血紅素鐵結(jié)合蛋白，屬于鐵糖結(jié)合蛋白中的一種，是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一員，在動(dòng)物的初乳中含量較為豐富[1]。乳鐵蛋白屬于乳清蛋白的一種，是生產(chǎn)干酪過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品之一，具有諸多生物活性[2]，抗菌活性是其中最重要的生物活性之一，其水解后的肽類具有更強(qiáng)的抑菌活性[3-7]。天然的抗菌肽(antibacterial peptide)又被稱為抗微生物肽、多肽抗生素，是一類小分子多肽，普遍具有很好的兩親性?？咕囊蚱洫?dú)特的抑菌機(jī)理，不易產(chǎn)生耐藥性，與天然抗生素相比更有優(yōu)勢(shì)[8]。國(guó)外利用乳鐵蛋白制備抗菌肽的研究相對(duì)較多，研究表明，胃蛋白酶水解乳鐵蛋白雖然會(huì)對(duì)其鐵結(jié)合能力和抗原性造成一定程度的損傷，但依舊會(huì)保持較好的抗菌活性[9]。

抗菌肽在食品加工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域都具有良好的發(fā)展前景和潛力?？咕目梢宰鳛榫G色天然的食品防腐劑[10]，因其具有耐高溫、耐酸的特性，能夠抑制和殺滅食品中的致病菌，從而減少化學(xué)添加劑的使用[11]?？咕姆€(wěn)定性和溶解性好，在作為食品防腐劑時(shí)不會(huì)由于加熱而使抗菌肽變性，避免了巴氏殺菌過(guò)程中的二次污染；在酸性食品和飲料中也不會(huì)失活，依舊具有活性，是一種具有較好應(yīng)用前景的天然食品防腐劑。由此可見(jiàn)，抗菌肽所具有的諸多生物學(xué)活性使得其在各個(gè)領(lǐng)域都極具優(yōu)勢(shì)，它的應(yīng)用也逐漸成熟和廣泛。

大孔吸附樹脂是一類非離子型吸附劑，具有高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，整個(gè)顆粒內(nèi)、外部都具有表面活性。它對(duì)化合物的吸附作用主要基于化合物的疏水基團(tuán)與非極性吸附劑之間的范德華引力，同時(shí)也通過(guò)本身的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)不同大小的分子加以篩選[12]?？咕囊话愣己幸欢ū壤氖杷园被?，可通過(guò)疏水相互作用吸附到樹脂的疏水表面。大多數(shù)乳鐵蛋白抗菌肽分子量在4000 Da以下，而Sephadex G-15和Sephadex G-25分離范圍分別小于1500 Da和1000～5000 Da，與乳鐵蛋白抗菌肽分子量范圍相契合。對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)，Sephadex葡聚糖凝膠具有良好的分離純化效果[13]，根據(jù)乳鐵蛋白抗菌肽的分子量及物化特性，采用Sephadex葡聚糖凝膠過(guò)濾層析對(duì)DA201大孔吸附樹脂處理后的乳鐵蛋白抗菌肽進(jìn)一步分離純化。本研究利用多種純化技術(shù)，分離出抑菌活性較強(qiáng)的多肽，有望將乳鐵蛋白抗菌肽開發(fā)成一種新型的天然食品添加劑，為乳鐵蛋白的開發(fā)和利用探索新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

乳鐵蛋白胃蛋白酶水解液：實(shí)驗(yàn)室自制；DA201大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠Sephadex G-15、Sephadex G-25：北京索萊寶科技有限公司；LB培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 微生物菌種

大腸桿菌(E.coli，ACTT51459)、金黃色葡萄球菌(S.aureus，ATCC29213)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.3 主要儀器與設(shè)備

MB99-2自動(dòng)液相色譜分離層析儀、HD-3紫外檢測(cè)儀、SDS-100自動(dòng)部分收集器、HL-2S恒流泵、HD-A層析圖譜采集分析儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；318 C+酶標(biāo)儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 抑菌活性的測(cè)定

選取G+菌金黃色葡萄球菌和G-菌大腸桿菌作為指示菌株，檢測(cè)乳鐵蛋白多肽物質(zhì)對(duì)指示菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration， MIC)。

LB培養(yǎng)基培養(yǎng)待測(cè)菌液至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，50 μL/孔加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后各孔中加入50 μL經(jīng)倍比稀釋的乳鐵蛋白抗菌肽溶液，以4%多聚甲醛溶液為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水為陰性對(duì)照，加入量均為50 μL。細(xì)菌在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)6 h，真菌在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h后[14]，用318 C+酶標(biāo)儀在λ=630 nm處檢測(cè)其OD值。以時(shí)間(0，0.5，1，2，4，6 h)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，與初始值相比，OD值未有顯著變化的最小乳鐵蛋白抗菌肽濃度定義為對(duì)該菌的最小抑菌濃度[15]。

1.4.2 多肽濃度測(cè)定

采用TNBS法測(cè)定[16]。

1.4.3 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)分析

于250 mL具塞錐形瓶中加入10 g預(yù)先處理過(guò)的干樹脂，加水充分溶脹，過(guò)濾吸干水分后加入50 mL 10 mg/mL或30 mg/mL的乳鐵蛋白抗菌肽溶液，于25 ℃恒溫振蕩12 h，每間隔1 h取樣，計(jì)算大孔吸附樹脂的吸附率(%)和吸附量 Q(mmol/g)[17]。

1.4.4 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附等溫線

于5個(gè)50 mL具塞錐形瓶中各加5 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔吸附樹脂，加水溶脹，過(guò)濾吸干水分，加入10 mL不同濃度(2.5，5，10，20，40 mg/mL)的乳鐵蛋白抗菌肽溶液，于25 ℃恒溫振蕩12 h，計(jì)算大孔吸附樹脂的平衡吸附量Qe(mmol/g)，作平衡吸附量 Qe與乳鐵蛋白抗菌肽濃度圖以得到大孔吸附樹脂的吸附等溫線。

1.4.5 大孔吸附樹脂的靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

取吸附平衡的大孔吸附樹脂5 g于50 mL具塞錐形瓶中，選擇水和不同濃度的乙醇溶液(25%、40%、55%、70%、85%)30 mL作為洗脫劑進(jìn)行解吸，解吸24 h，按下式計(jì)算解吸率(%)：

1.4.6 DA201大孔吸附樹脂初步分離抗菌肽

參考王新保[18]的方法，稍作修改。規(guī)格為2.5 cm×60 cm的層析柱中裝入一定量的大孔吸附樹脂，去離子水以2 mL/min的流速流經(jīng)層析柱約30～60 min至基線平衡。濃度為30 mg/mL的乳鐵蛋白酶解液10 mL在2 mL/min流速下上樣層析柱，用去離子水2 mL/min的流速洗滌層析柱至A220 nm無(wú)吸收，用85%乙醇以1 mL/min的流速洗脫層析柱。收集洗脫峰并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸去乙醇，洗脫液在-80 ℃條件下預(yù)凍過(guò)夜后冷凍干燥得到凍干粉。按下式計(jì)算乳鐵蛋白抗菌肽回收率：

1.4.7 凝膠過(guò)濾色譜分離純化抗菌肽

參考李暢[19]的方法，稍作修改。先用Sephadex G-25層析柱分離，再用Sephadex G-15層析柱繼續(xù)純化。以0.1 mol/L，pH 6.0的PBS溶液為流動(dòng)相，以1 mL/min的流速平衡層析柱約30～60 min至基線平衡。將凍干粉樣品配成溶液并用0.45 μm的醋酸纖維素膜過(guò)濾后上樣，上樣量為凝膠總體積的1%～5%，流動(dòng)相為相同的PBS緩沖溶液。檢測(cè)A220 nm，以分析儀記錄洗脫圖譜，收集各洗脫峰，洗脫液在-80 ℃條件下預(yù)凍過(guò)夜后冷凍干燥，得各洗脫組分凍干粉。

Sephadex G-25洗脫條件：層析柱為1.6 cm×50 cm，上樣量為1 mL，洗脫速度為0.5 mL/min，上樣濃度為20 mg/mL，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為220 nm。

Sephadex G-15洗脫條件：層析柱為1.0 cm×40 cm，上樣量為1 mL，洗脫速度為0.5 mL/min，上樣濃度為10 mg/mL，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為220 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白水解物的抑菌活性

測(cè)定未經(jīng)分離純化處理的乳鐵蛋白胃蛋白酶水解物的最小抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳鐵蛋白水解物的最小抑菌濃度

由表1可知，未經(jīng)分離純化處理的乳鐵蛋白水解物具有一定的抗菌活性，抗菌活性為MICE. coli=0.5 mg/mL和MICS. aureus=0.5 mg/mL。

2.2 DA201大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在靜態(tài)吸附過(guò)程中，大孔吸附樹脂對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的吸附率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而有一定規(guī)律性的變化，即DA201大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(25 ℃)能夠很好地反映出吸附量與時(shí)間之間的變化關(guān)系，具體關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 DA201大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(25 ℃)

由圖1可知，DA201大孔吸附樹脂對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的吸附屬于快速且平衡型，對(duì)于不同濃度的乳鐵蛋白抗菌肽溶液，隨著時(shí)間的增加其吸附速率均加快，并且均呈現(xiàn)出先迅速上升后緩慢上升并逐漸趨于平緩的趨勢(shì)，開始的前1 h吸附速度很快，之后較快吸附就達(dá)到平衡。濃度為10 mg/mL的乳鐵蛋白抗菌肽溶液吸附率達(dá)到91.44%；而濃度為30 mg/mL的乳鐵蛋白抗菌肽溶液吸附率達(dá)到96.58%。兩個(gè)濃度溶液之間吸附率差別較小(P>0.05)。達(dá)到吸附平衡所需的時(shí)間略有不同，從結(jié)果來(lái)看，通過(guò)增加吸附液的濃度可以適當(dāng)縮短吸附時(shí)間，并且快速吸附能力有利于吸附的進(jìn)行。

2.3 DA201大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附等溫線

DA201大孔吸附樹脂在室溫條件下對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的吸附等溫曲線見(jiàn)圖2。

圖2 DA201大孔吸附樹脂對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的平衡吸附量(25 ℃)

由圖2可知，DA201大孔吸附樹脂的吸附能力隨著乳鐵蛋白抗菌肽濃度的增加而呈正比例上升，濃度越大，DA201大孔吸附樹脂的吸附量越大。當(dāng)平衡吸附量(mmol/g)對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽濃度(mg/mL)作圖后，得到一元一次線性方程y=4.3231x+1.0329，得到此方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9977，符合分析要求。根據(jù)該方程可以計(jì)算出DA201大孔吸附樹脂對(duì)不同濃度的乳鐵蛋白抗菌肽的平衡吸附量。

2.4 乳鐵蛋白抗菌肽的靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

可以通過(guò)改變體系的兩親性平衡來(lái)增加大孔吸附樹脂對(duì)蛋白質(zhì)多肽的吸附和解吸能力。不同洗脫劑的洗脫效果不同，溶解度參數(shù)也不同，溶劑的溶解度參數(shù)與解吸效果相關(guān)，溶解度參數(shù)越大的溶劑解吸效果越差。常見(jiàn)的洗脫劑有水、甲醇、乙醇和丙酮，其對(duì)應(yīng)的溶解度分別為23.2%、14.5%、12.7%、10.0%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，并考慮溶劑的安全性，選擇乙醇-水溶劑作為本階段實(shí)驗(yàn)的洗脫劑來(lái)進(jìn)行解吸。

在室溫條件下，分別用水和不同濃度的乙醇-水溶劑對(duì)已經(jīng)吸附乳鐵蛋白抗菌肽且達(dá)到平衡的DA201大孔吸附樹脂進(jìn)行解吸，解吸24 h后測(cè)定不同洗脫劑的解吸率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同洗脫劑對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的解吸效果

由表2可知，水的解吸率比乙醇低，僅有3.84%，洗脫效果并不明顯。而當(dāng)乙醇作為解吸劑時(shí)，解吸率會(huì)隨著乙醇濃度的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度升高到55%時(shí)，其解吸率成倍上升，達(dá)到20.39%，再增加乙醇濃度，其解吸率變化更為明顯，在濃度為85%時(shí)解吸率已達(dá)到79.99%，說(shuō)明增加乙醇的濃度有利于解吸效率的提高。

2.5 DA201大孔吸附樹脂分離分析乳鐵蛋白水解物

為保證較好的洗脫效果，通常情況下解吸過(guò)程中的流速是吸附過(guò)程的1/2，甚至更慢。乳鐵蛋白水解物利用大孔吸附樹脂DA201進(jìn)行初步分離純化的條件為：上樣流速2 mL/min，洗脫流速1 mL/min。層析圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 DA201大孔吸附樹脂對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的動(dòng)態(tài)吸附

由圖3可知，利用85%乙醇洗脫層析柱，在3 h左右會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，收集洗脫峰并冷凍干燥，初步分離后的乳鐵蛋白抗菌肽凍干粉的回收率為59.25%。乳鐵蛋白水解物中具有一定疏水性的小肽，可利用疏水相互作用從水相吸附到大孔吸附樹脂的疏水表面，實(shí)現(xiàn)初步的分離，脫除水解物中的無(wú)機(jī)鹽。從洗脫圖譜可以看出曲線有明顯的拖尾現(xiàn)象，這或許是由于乳鐵蛋白抗菌肽中所存在的相對(duì)分子量較大的物質(zhì)在85%的乙醇溶液中的溶解度相對(duì)較低，而無(wú)法被洗脫下來(lái)。

測(cè)定經(jīng)過(guò)DA201大孔吸附樹脂初步分離后乳鐵蛋白抗菌肽的最小抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果為MICE. coli=0.25 mg/mL，MICS. aureus=0.25 mg/mL。從結(jié)果可以看出，通過(guò)DA201大孔吸附樹脂初步分離后的乳鐵蛋白抗菌肽對(duì)E.coli和S.aureus的抗菌活性分別提高了1倍。

2.6 Sephadex G-25過(guò)濾色譜分離分析乳鐵蛋白抗菌肽

確定葡聚糖凝膠色譜分離過(guò)程的條件為以去離子水作為洗脫劑，洗脫速度為0.25 mL/min，上樣濃度為20 mg/mL，上樣體積為1 mL。通過(guò)上述條件對(duì)利用DA201大孔吸附樹脂初步分離得到的乳鐵蛋白抗菌肽經(jīng)過(guò)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離純化，得到的層析圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 Sephadex G-25對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的過(guò)濾色譜分離

凝膠色譜是根據(jù)樣品分子量大小的不同而進(jìn)行分離。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱[20]。從分離結(jié)果可以看出，脫鹽乳鐵蛋白抗菌肽經(jīng)過(guò)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化后，得到了a、b、c 3個(gè)主峰，分離效果較好。

對(duì)分離得到的3個(gè)峰的洗脫液進(jìn)行收集，測(cè)定其抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Sephadex G-25各分離純化組分的最小抑菌濃度

由表3可知，組分a對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均沒(méi)有抑菌活性。組分b相比組分c，其抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，MICE.coli=0.125 mg/mL，MICS.aureus=0.125 mg/mL。從層析圖譜可以看出，組分a的相對(duì)分子質(zhì)量最大，組分b次之，組分c的相對(duì)分子質(zhì)量最小，說(shuō)明具有抑菌活性的多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布在某一范圍內(nèi)，相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大或過(guò)小對(duì)于乳鐵蛋白水解物來(lái)說(shuō)其抑菌活性均不顯著。因此，選擇組分b進(jìn)行下一步的分離純化。

2.7 Sephadex G-15過(guò)濾色譜分離分析乳鐵蛋白抗菌肽

以去離子水作為洗脫劑，上樣濃度為10 mg/mL，上樣體積為1 mL，洗脫速度為0.25 mL/min，將組分b經(jīng)過(guò)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離純化，得到的層析圖譜見(jiàn)圖5。

圖5 Sephadex G-15對(duì)乳鐵蛋白抗菌肽的過(guò)濾色譜分離

由圖5可知，組分b經(jīng)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)一步分離后得到2個(gè)組分，分別為組分b-1和組分b-2。

對(duì)分離得到的2個(gè)峰的洗脫液進(jìn)行收集，測(cè)定其抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Sephadex G-15各分離純化組分的最小抑菌濃度

抗菌肽作為一種具有廣譜抑菌活性的多肽，對(duì)不同菌株表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的抑菌活性[21]，對(duì)于G+菌和G-菌同樣也存在抑菌能力的差異。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，組分b-2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均沒(méi)有抑菌活性；金黃色葡萄球菌對(duì)組分b-1比較敏感，MICS.aureus=0.0625 mg/mL，大腸桿菌相對(duì)較弱，MICE. coli=0.125 mg/mL。乳鐵蛋白抗菌肽表現(xiàn)出的抑菌差異性可能是由于不同G+、G-菌的細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)不同[22]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附、解吸行為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，再通過(guò)DA201大孔吸附樹脂和凝膠過(guò)濾色譜逐步分離純化得到具有抑菌活性的抗菌肽。未經(jīng)分離純化處理的乳鐵蛋白抗菌肽的抗菌活性為MICE. coli=0.5 mg/mL和MICS. aureus=0.5 mg/mL。大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)得出濃度為10 mg/mL和30 mg/mL的乳鐵蛋白抗菌肽溶液吸附率分別為91.14%和96.58%，并得到吸附等溫線；靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解吸效果最好的洗脫劑為85%乙醇溶液，解吸率為79.99%；確定動(dòng)態(tài)吸附解吸過(guò)程的流速條件為：上樣流速2 mL/min、洗脫流速1 mL/min，收集洗脫峰得到產(chǎn)物回收率為59.25%；經(jīng)過(guò)DA201大孔吸附樹脂初步分離純化得到的乳鐵蛋白抗菌肽抗菌活性為MICE. coli=0.25 mg/mL和MICS. aureus=0.25 mg/mL，所得產(chǎn)物抗菌活性提高了1倍。經(jīng)過(guò)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化得到的組分b抗菌活性為MICE. coli=0.125 mg/mL，MICS. aureus=0.125 mg/mL，E.coli抗菌活性變化不明顯，S.aureus抗菌活性提高了1倍；經(jīng)過(guò)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜對(duì)組分b進(jìn)一步純化后得到的組分b-1抗菌活性為MICE. coli=0.125 mg/mL，MICS. aureus=0.0625 mg/mL，抗菌活性分別提高了1倍，實(shí)現(xiàn)了抗菌肽的分離純化。

目前利用大孔吸附樹脂和Sephadex凝膠過(guò)濾色譜法聯(lián)用對(duì)抗菌肽進(jìn)行分離純化，是制備抗菌肽的優(yōu)勢(shì)方法之一。而抗菌肽作為乳鐵蛋白中的一種多肽，通過(guò)對(duì)其的分離純化進(jìn)而探索和挖掘其潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望將乳鐵蛋白水解物開發(fā)成新型的天然食品添加劑，為乳鐵蛋白的開發(fā)和利用探索新的途徑。