基于譜-效相關(guān)分析的西紅花抗抑郁藥效成分的研究

李 萌，章從恩，章 前，于衛(wèi)東，陳 熹，馬致潔#，趙奎君#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050；2.北京科園信海醫(yī)藥經(jīng)營有限公司，北京 100160；3.上海市藥材公司，上海 200002)

鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.原產(chǎn)于地中海地區(qū)，現(xiàn)已種植在阿富汗、希臘、西班牙和印度等地[1]。我國于1965年開始引種試驗，現(xiàn)已成功在上海、云南、浙江、江蘇和新疆等地培育成功[1-2]。西紅花為其干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒和解郁安神之功效[3-4]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，大量的科學(xué)研究考察了西紅花治療或預(yù)防精神疾病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤等的可能功效[5-7]。其中，西紅花已被大量研究結(jié)果證實具有抗抑郁的作用，成為一種很有前途的治療抑郁癥的中藥[8-11]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地西紅花藥材中主要成分含量差異較大[1]。這些差異是否會造成其藥效學(xué)的不同，具體哪些成分在其抗抑郁中起主要貢獻(xiàn)作用，尚不明確。為了明確成分與生物效應(yīng)的關(guān)系，本研究首先比較了不同產(chǎn)地西紅花藥材抗抑郁效應(yīng)的差異，進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計分析，將化學(xué)成分與其生物效應(yīng)進(jìn)行多元線性回歸分析，尋找與其抗抑郁作用藥效學(xué)相關(guān)的主要化學(xué)成分，為其抗抑郁作用研究提供科學(xué)參考[12-14]。

1 材料

1.1 儀器

HPLC-IT-TOF/MS液相色譜串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜(LC-MS)、Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)均購自日本島津公司；Centrifuge 5424R小型冷凍高速離心機、Research Plus單道手動型微量移液器均購自德國Eppendorf公司；NV-425-400s Labgard生物安全柜、NV-5510E CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自美國Nuaire公司；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS205型電子分析天平[梅特勒-托利多科技(中國)有限公司]；BSA224S-CW電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；Leica DMi1倒置生物顯微鏡(德國Leica公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；SpectraMax M3酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)；TC20細(xì)胞計數(shù)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥品與試劑

實驗所用西紅花藥材均由上海藥材有限公司提供(產(chǎn)地信息見表1)，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭。RPMI Medium 1640 basic(1×)培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS，美國HyClone公司)；100×青霉素-鏈霉素溶液(P/S，北京蘭杰柯科技有限公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，北京索萊寶科技有限公司)；0.25%Trypsin-EDTA(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；皮質(zhì)酮(CORT，美國Sigma公司)。

表1 西紅花藥材的產(chǎn)地信息Tab 1 Origin information of saffron

2 方法

2.1 藥材樣品制備

2.1.1 液相樣品制備：精密稱定10個不同產(chǎn)地西紅花藥材粉末各100 mg，分別置于50 mL棕色具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇溶液20 mL，稱量質(zhì)量，置于冰水中超聲處理30 min(功率為150 W，頻率為40 Hz)，取出，再次稱量質(zhì)量，用75%乙醇溶液補足減少的質(zhì)量，混勻，過濾，4 ℃儲存?zhèn)溆肹11]。

2.1.2 細(xì)胞實驗樣品制備：稱量10個不同產(chǎn)地西紅花藥材樣品各100 mg，粉碎后加入75%乙醇溶液20 mL于冰水中超聲提取30 min(功率為150 W，頻率為40 Hz)，過濾，冷凍干燥，得提取物(避光操作)。將西紅花提取物溶于水中，配置成0.2 mg/mL儲備液(按照生藥材計算)，用0.22 μm的微孔濾器除菌，4 ℃儲存?zhèn)溆肹11]。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件：Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(5%甲醇/95%水-95%甲醇/5%水)，梯度洗脫(0～5 min，5%B；5～10 min，10%B；10～20 min，25%B；20～25 min，50%B；25～30 min，80%B；30～35 min，95%B)；流速為1 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件：電噴霧化離子源，負(fù)離子檢測(離子源溫度為120 ℃)；毛細(xì)管電壓為3 200 V，質(zhì)量掃描范圍m/z為100～1 000；干燥氣體積流量為10 L/min；干燥氣溫度為300 ℃。

2.3 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

PC12細(xì)胞(購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)在含有5%CO2、溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)基+10%FBS+1%P/S。4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細(xì)胞實驗方法及西紅花藥效檢測

取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，以2×104個/孔細(xì)胞向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種，培養(yǎng)24 h后，按照以下方式分組：(1)正常對照組(NC)：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理；(2)CORT損傷模型組：以CORT 500 μmol/L 處理；(3)西紅花給藥組：含1%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋西紅花儲備液至5 μg/mL，均預(yù)給藥24 h，之后加入CORT 500 μmol/L 處理24 h，結(jié)束后采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率[11]。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜建立

本研究在課題組前期研究結(jié)果上，按照上述樣品制備方法和液相質(zhì)譜條件，建立10個不同產(chǎn)地西紅花藥材化學(xué)指紋圖譜，見圖1。并從質(zhì)譜離子流圖譜信息中初步指認(rèn)西紅花藥材的主要成分，見表2—3[15-16]。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 西紅花藥材的化學(xué)成分鑒定(ESI+)Tab 2 Identification of chemical components of saffron(ESI+)

表3 西紅花藥材的化學(xué)成分鑒定(ESI-)Tab 3 Identification of chemical components of saffron (ESI-)

3.2 不同產(chǎn)地西紅花藥效檢測結(jié)果

采用不同產(chǎn)地相同濃度西紅花預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后，加入CORT 500 μmol/L作用24 h，細(xì)胞存活率均較模型組有所提高，見表4。

表4 細(xì)胞存活率

3.3 西紅花主要成分與抗抑郁效應(yīng)的簡單相關(guān)及多元回歸分析

3.3.1 西紅花主要共有峰面積與藥效的簡單相關(guān)分析：為了獨立考察各成分與藥效之間的相關(guān)性，以各產(chǎn)地西紅花藥效為因變量Y，以西紅花樣品中主要的11個共有峰面積為自變量x1—x11，分別采用SPSS軟件單獨進(jìn)行簡單相關(guān)分析[17-18]。結(jié)果顯示，西紅花的幾個主要成分的相對峰面積與藥效指標(biāo)存在一定的正相關(guān)性，x8與Y的簡單相關(guān)系數(shù)為0.860(P=0.001<0.01)，提示西紅花苷-Ⅰ相對含量與西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用藥效具有較強的正相關(guān)性；x9與Y的簡單相關(guān)系數(shù)為0.715(P=0.020<0.05)，提示西紅花苷-Ⅱ相對含量與西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用藥效具有一定的正相關(guān)性；x11與Y的簡單相關(guān)系數(shù)為0.572(P=0.048<0.05)，提示藏花醛相對含量與西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用藥效具有一定的正相關(guān)性，見表5。

表5 西紅花主要成分與抗抑郁效應(yīng)的簡單相關(guān)分析結(jié)果Tab 5 Simple correlation analysis between main components of saffron and antidepressant effects

3.3.2 多元相關(guān)分析：采用SAS 9.2(SAS Inc.,USA)軟件進(jìn)行多元回歸的方法探討西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用藥效與成分之間的相關(guān)性[19-21]?；貧w模型中，以各產(chǎn)地西紅花藥效為因變量Y，以西紅花各產(chǎn)地樣品中的11個共有峰面積為自變量x1—x11，因自變量較多，故首先進(jìn)行了共線性診斷，結(jié)果表明回歸模型存在較嚴(yán)重的共線性，因此，本研究采用主成分回歸分析探討西紅花藥效學(xué)與成分之間的相關(guān)性[20-21]。通過SAS 9.2軟件進(jìn)一步分析，得到了回歸矩陣中各主成分的特征值及貢獻(xiàn)率，見表6。由表6可知，變量Z1、Z2和Z3累計貢獻(xiàn)率>0.85，剔除其他主成分，選擇Z1、Z2和Z33個主成分完成回歸模型的建立。將主成分Z1、Z2和Z3的系數(shù)代入回歸模型中，得到因變量Y與標(biāo)準(zhǔn)化后的自變量X1—X11的線性回歸模型，再按照標(biāo)準(zhǔn)化公式X=(x-Mean)/STD，將標(biāo)準(zhǔn)化后的變量轉(zhuǎn)換為原始自變量，得到因變量Y1與原始變量x1—x11的線性回歸方程[20-21]。公式為Y=0.377 7+(1.796 5x1-5.691 7x2+1.912 5x3-4.948 7x4+6.298 3x5-5.481 2x6-7.123 9x7+20.428 1x8+17.734 9x9-3.892 4x10+9.929x11)×10-9。上述主成分回歸分析結(jié)果顯示，擬合的回歸模型中，R2=0.962 1，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002 5<0.05)。由回歸模型公式可知，變量x8、x9和x11(西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛)具有較大的參數(shù)值，說明西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛可能對西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用藥效有較大的貢獻(xiàn)度。

表6 主成分回歸分析結(jié)果Tab 6 Results of principal component regression analysis

4 討論

本研究通過對比10個不同產(chǎn)地西紅花藥材對細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地西紅花藥材之間的藥效存在差異。通過藥效學(xué)結(jié)果與11個共有峰相對峰面積的簡單相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛與藥效學(xué)均有一定正相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)R>0.80為指標(biāo)，可初步確定西紅花苷-Ⅰ可能是西紅花抗抑郁作用相關(guān)性較強的成分；通過藥效學(xué)結(jié)果與11個共有峰相對峰面積的主成分回歸分析，發(fā)現(xiàn)擬合的回歸的模型中，R2=0.962 1，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002 5<0.05)。由回歸模型可知，變量x8、x9和x11(西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛)具有較大的參數(shù)值，說明西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛可能對西紅花的抗抑郁作用藥效有較大的貢獻(xiàn)度。綜合簡單相關(guān)分析與多元回歸分析結(jié)果，初步認(rèn)為西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ和藏花醛可能與西紅花對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用具有較強的相關(guān)性，提示其在西紅花抗抑郁作用上具有較大的貢獻(xiàn)。

本研究為明確西紅花抗抑郁成分，以及后續(xù)合理有效控制其質(zhì)量、發(fā)揮其臨床藥用價值的研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。但也存在不足，為進(jìn)一步驗證該結(jié)果，課題組將于后續(xù)研究中購買或自制標(biāo)準(zhǔn)品，通過動物實驗與生物實驗相結(jié)合的方法，對實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證與更深入的探索。