穿心蓮內(nèi)酯對膜性腎病大鼠腎纖維化的影響及其機制研究Δ

周 靖，郭洋洋，陸春紅，黃金杰，王 丹

(1.開灤總醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.廊坊市第四人民醫(yī)院內(nèi)二科，河北 廊坊 065700)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)為成人腎病綜合征的常見病理類型，以腎小球基底膜增厚及上皮下免疫復合物彌漫性沉積為主要病理特征。MN約占原發(fā)性腎小球疾病的10%，其中約30%的患者可自行緩解，但約40%的患者在發(fā)病10年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病[1]。MN發(fā)病機制復雜，其中腎纖維化在MN疾病進展過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。穿心蓮內(nèi)酯是傳統(tǒng)中藥穿心蓮的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用[4-5]。有研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯對四氯化碳所致肝纖維化、博來霉素所致肺纖維化均具有明顯的抑制作用[6-7]。但穿心蓮內(nèi)酯對MN的影響尚未見文獻報道。本研究旨在探討穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎纖維化的影響及相關機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠80只，體重210～240 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物學部提供[SCXK(冀)2018-004]，清潔環(huán)境(溫度為23～25 ℃，濕度為55%～65%)飼養(yǎng)，自由飲水進食。實驗方案經(jīng)開灤總醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 儀器

CL-8000型生化分析儀(日本Shimadzu公司)；UF-1000i型尿液分析儀(日本SYSMEX公司)；RT-6000型酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；JEM1400 Flash型透射電鏡(日本JEOL公司)；RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司)；164-5050 型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；DYCZ-40 D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

陽離子化牛血清白蛋白購自北京索萊寶生物科技有限公司(批號：SA8130)；弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司(批號：P6556)；穿心蓮內(nèi)酯購自廣東萬年青制藥股份有限公司(批號：202005018)；鹽酸貝那普利購自成都地奧制藥集團有限公司(批號：201006)；肌酐(SCr)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：200109)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒及增強型化學發(fā)光液(ECL)超敏發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：G1120、G1340及SW2030)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)及細胞間黏附分子-1(ICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：200105、200413及200407)；Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、β-肌動蛋白(β-actin)和免疫球蛋白G二抗購自北京博奧森生物科技有限公司(貨號：bs-20595R、bs-20355R、bs-0086R、bs-2224R、bs-23581R、bs-975R、bs-0837R、bs-0061R和bs-0295G)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥：(1)分組。適應性飼養(yǎng)1周后，將80只大鼠隨機分為正常組、模型組、穿心蓮內(nèi)酯組(穿心蓮內(nèi)酯50 mg/kg)和貝那普利組(鹽酸貝那普利10 mg/kg)，各20只。(2)造模。參照文獻報道的方法，將20 mg陽離子化牛血清白蛋白溶于0.9%氯化鈉溶液30 mL中，加入等量弗氏不完全佐劑并充分乳化，于雙腋下和雙腹股溝2日1次、共3次皮下注射乳化液1 mL，進行預免疫；尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白16 mg/kg進行正式免疫(2日1次、共15次)；通過尿蛋白試紙檢測，結(jié)果為尿蛋白陽性即可判定造模成功[8-9]。(3)給藥。穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組大鼠分別連續(xù)4周灌胃給藥，1日1次；正常組和模型組連續(xù)4周灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，1日1次。

1.4.2 腎功能指標水平檢測：給藥完成后，每組隨機取10只大鼠，收集24 h尿液，通過磺基水楊酸法測定24 h尿蛋白定量；麻醉，經(jīng)腹主動脈取血并離心取血清，然后按照試劑盒說明書依步進行處理，通過全自動生化分析儀測定SCr含量。

1.4.3 通過HE、Masson染色進行腎組織病理學檢查：采血完成后，頸椎脫臼處死大鼠，在冰上取雙側(cè)腎組織，左側(cè)腎臟置于4%甲醛溶液固定3 d、常規(guī)脫水和透明處理后，石蠟包埋、切片(厚度5 μm)，按照試劑盒說明書進行HE染色和Masson染色，然后通過光學顯微鏡觀察腎組織病理學改變和纖維化狀況(Masson染色圖片中藍色為膠原著色)。通過圖像分析軟件計算膠原容積分數(shù)(CVF)。

1.4.4 通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化：取右側(cè)腎臟，經(jīng)4 ℃、0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后置入濃度為3%的戊二醛溶液(pH=7.4)中固定3 d，以蔗糖緩沖液清洗、1%鋨酸固定1 h、乙醇和丙酮混合液梯度脫水后進行包埋，60 nm厚度超薄切片后，經(jīng)醋酸鈾避光染色10 min、檸檬酸鉛染色10 min后，通過TEM觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測腎組織TNF-α、IL-6和ICAM-1含量：取各組剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，在冰上取雙側(cè)腎臟，左側(cè)腎臟經(jīng)剪碎、按1 ∶ 8的質(zhì)量體積比加入4 ℃預冷裂解液、勻漿處理后，冰上靜置1 h使其充分裂解，4 ℃離心(半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，時間10 min)取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒操作方法處理后，通過酶標儀檢測TNF-α、IL-6和ICAM-1含量。

1.4.6 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測腎組織TLR4、NF-κB、TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平：取右側(cè)腎臟，參照“1.4.5”項下方法進行腎臟組織勻漿、裂解，4 ℃、12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心取上清液，測定總蛋白后以30 μg蛋白量上樣、凝膠電泳(80 V，40 min；160 V，90 min)分離蛋白、濕法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(300 mA，90 min)、5%脫脂奶粉常溫封閉90 min后，加目標蛋白[TLR4(1 ∶ 1 000)、NF-κB(1 ∶ 1 000)、TGF-β1(1 ∶ 1 000)、磷酸化Smad2(1 ∶ 800)、磷酸化Smad3(1 ∶ 800)、Ⅰ型膠原蛋白(1 ∶ 1 000)、Ⅲ型膠原蛋白(1 ∶ 1 000)]和β-actin(1 ∶ 2 000)一抗4 ℃孵育12 h，TBST洗膜后加二抗(1 ∶ 3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后加ELC發(fā)光劑，通過凝膠成像儀顯示蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參、通過條帶灰度值半定量目標蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量的影響

模型組大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明顯高于正常組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明顯低于模型組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組24 h尿蛋白定量和血清SCr含量均明顯低于貝那普利組(P<0.05)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠24 h尿蛋白定量和血清SCr含量的影響Tab 1 Effects of andrographolide on 24 h urinary protein quantification and serum SCr in MN rats

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織病變的影響

HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠可見腎細胞固縮、腎間質(zhì)炎細胞浸潤、腎小球及間質(zhì)區(qū)大量膠原沉積等病理學改變；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組腎組織病變均明顯減輕，腎小球和腎間質(zhì)僅可見絲狀膠原沉積，其中穿心蓮內(nèi)酯組效果更為顯著，見圖1—2。模型組的CVF明顯高于正常組[(23.71±3.80)%vs.(9.54±1.29)%，P<0.01]；穿心蓮內(nèi)酯組、貝那普利組的CVF明顯低于模型組[(12.09±2.41)%vs.(23.71±3.80)%，(15.38±2.75)%vs.(23.71±3.80)%，P<0.01]；穿心蓮內(nèi)酯組的CVF明顯低于貝那普利組[(12.09±2.41)%vs.(15.38±2.75)%，P<0.05]，上述差異均有統(tǒng)計學意義。

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖1 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織病變的影響(HE染色)Fig 1 Effects of andrographolide on renal tissue lesions in MN rats (HE staining)

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖2 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織纖維化的影響(Masson染色)Fig 2 Effects of andrographolide on renal tissue fibrosis in MN rats (Masson staining)

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)病變的影響

正常組腎組織基底膜、足突形態(tài)正常，上皮下未見電子致密物沉淀；模型組腎組織可見基底膜不規(guī)則增厚，足突排列紊亂、部分消失或融合，上皮下可見大量電子致密物沉積等超微結(jié)構(gòu)病變；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組腎組織超微結(jié)構(gòu)病變均明顯減輕，其中穿心蓮內(nèi)酯組效果更為顯著，見圖3。

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖3 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響(×10 000)Fig 3 Effects of andrographolide on ultrastructural changes of renal tissue in MN rats (×10 000)

2.4 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TNF-α、IL-6和ICAM-1含量的影響

模型組的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量明顯高于正常組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量均明顯低于模型組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組的TNF-α、IL-6和ICAM-1含量明顯低于貝那普利組(P<0.05或P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TNF-α、IL-6和ICAM-1含量的影響Tab 2 Effects of andrographolide on contents of TNF-α,IL-6,ICAM-1 in renal tissue of MN rats

2.5 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平的影響

模型組大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平明顯高于正常組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組TLR4、NF-κB蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組TLR4、NF-κB蛋白表達水平明顯低于貝那普利組(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見圖4、表3。

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖4 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平的影響Fig 4 Effects of andrographolide on expressions of TLR4,NF-κB protein in renal tissue of MN rats

表3 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平的影響Tab 3 Effects of andrographolide on expressions of TLR4,NF-κB protein in renal tissue of MN rats

2.6 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表達水平的影響

模型組大鼠腎組織TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表達水平明顯高于正常組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表達水平明顯低于貝那普利組(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見圖5、表4。

表4 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3蛋白表達水平的影響Tab 4 Effects of andrographolide on expressions of TGF-β1,phosphorylated Smad2,phosphorylated Smad3 protein in renal tissue of MN rats

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖5 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織TGF-β1、磷酸化Smad2和磷酸化Smad3蛋白表達水平的影響Fig 5 Effects of andrographolide on expressions of TGF-β1,phosphorylated Smad2,phosphorylated Smad3 protein in renal tissue of MN rats

2.7 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平的影響

模型組大鼠腎組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平明顯高于正常組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組和貝那普利組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.01)；穿心蓮內(nèi)酯組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平明顯低于貝那普利組(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學意義，見圖6、表5。

A.正常組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯組；D.貝那普利組A.normal group;B.model group;C.andrographolide group;D.benazepril group圖6 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平的影響Fig 6 Effects of andrographolide on expressions of type Ⅰ and type Ⅲ collagen protein in renal tissue of MN rats

表5 穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達水平的影響Tab 5 Effects of andrographolide on expressions of type Ⅰ and type Ⅲ collagen protein in renal tissue of MN rats

3 討論

MN是成人腎病綜合征的主要致病因素，具有高發(fā)病率和高風險性，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅著人們的生命健康。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MN患者并發(fā)腎纖維化的比例>60%[10]。蔡小凡等[11]的研究結(jié)果表明，腎纖維化發(fā)生程度是決定腎臟疾病預后的重要因素，抑制纖維化能夠有效延緩MN向終末期生的轉(zhuǎn)變。目前，臨床上對于MN的治療主要采取糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑的方案[12-13]。但腎纖維化得不到很好的控制，是MN治療中仍待解決的難題。

中醫(yī)藥在我國具有悠久的應用歷史，MN在中醫(yī)屬于“尿濁”“水腫”等范疇，其病機在于“脾腎虧虛，水濕、痰濁、瘀血、濁毒潛藏腎絡”，日久則腎絡癥積，形成腎纖維化[14]。穿心蓮屬于爵床科穿心蓮屬一年生草本植物，其干燥地上部分入藥，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血消腫的功效。穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮的主要活性成分，屬于二萜類內(nèi)酯化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性，對急性腎衰竭、糖尿病腎病和原發(fā)性腎病綜合征等多種腎臟疾病具有治療作用[15-16]。此外，Das等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能夠通過抑制NF-κB通路抑制腎炎小鼠腎組織纖維化。貝那普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能夠明顯改善MN大鼠的腎功能，降低尿蛋白量，是MN動物實驗研究常用的陽性對照藥物[18]。本研究通過尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白制備MN大鼠模型，24 h尿蛋白定量和血清SCr含量明顯升高，腎組織呈現(xiàn)細胞固縮、炎癥浸潤、腎小球及間質(zhì)區(qū)大量膠原沉積等病理學改變，并可見基底膜不規(guī)則增厚、足突排列紊亂、部分消失或融合、上皮下可見大量電子致密物沉積等超微結(jié)構(gòu)病變，與高飛等[19]的研究結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯或貝那普利治療能夠明顯降低24 h尿蛋白定量和SCr含量，明顯改善組織病變和超微結(jié)構(gòu)病變，且穿心蓮內(nèi)酯(50 mg/kg)的效果優(yōu)于貝那普利(10 mg/kg)，提示穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎組織纖維化等病變具有抑制作用，對腎功能具有改善作用。

腎纖維化機制復雜，多種因素參與其病理進展過程。MN所致腎臟免疫微環(huán)境改變，腎小球細胞、腎間質(zhì)細胞和系膜細胞等釋放TNF-α、IL-6及ICAM-1等炎癥細胞因子，致使腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤而引發(fā)炎癥反應。楊霜等[24]和鄭鐵騎等[25]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥反應能夠促進腎細胞表型轉(zhuǎn)化，進而釋放腎毒性因子、生長因子等，促進腎纖維化。IL-6主要由系膜細胞釋放，能夠促進EMC生成。高雅嬋等[26]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6的促纖維化作用與IL-6含量呈正相關。TNF-α具有炎癥趨化因子屬性，能夠進一步促進炎癥細胞因子釋放，并促進前列腺素、單核細胞趨化蛋白-1等表達，促進ICAM-1表達與釋放而增加內(nèi)皮通透性和炎癥細胞浸潤，從而促進腎纖維化進展[27]。Toll樣受體(TLR)是一類跨膜識別受體，在機體免疫應答及炎癥反應調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的信號傳導作用；NF-κB為TLR4下游靶基因，能夠被TLR4誘導表達與活化，活化NF-κB核轉(zhuǎn)位后能夠誘導TNF-α、IL-6和ICAM-1等炎癥因子釋放，從而加重炎癥反應[28]。因此，TLR4/NF-κB信號通路在炎癥反應過程中具有重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯或貝那普利治療能夠明顯降低MN大鼠腎組織TNF-α、IL-6和ICAM-1含量，下調(diào)TLR4、NF-κB表達，與Li等[29]的研究結(jié)果一致，且穿心蓮內(nèi)酯(50 mg/kg)的效果優(yōu)于貝那普利(10 mg/kg)，提示穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠的炎癥反應具有抑制作用，從而間接抑制腎纖維化，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯對MN大鼠腎纖維化具有抑制作用，可能與抑制TLR4/NF-κB通路和TGF-β1/Smad通路，進而抑制炎癥反應和細胞外基質(zhì)生成有關。本研究結(jié)果為穿心蓮內(nèi)酯作為MN治療備選藥物提供了理論支持。