三突變型缺氧誘導(dǎo)因子-1α對老年小鼠缺血后肢的促血管生成作用

謝佳佳 廖文君 吳碧君 唐其東 李瑜輝

(1.廣東省第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510317；2.廣東省第二人民醫(yī)院超聲科，廣東 廣州 510317)

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是細(xì)胞對低氧作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，在低氧狀態(tài)下可穩(wěn)定表達(dá)，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1等上百種靶基因的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)這些基因表達(dá)，誘導(dǎo)生理功能完整的新生血管，促進(jìn)側(cè)支血管的灌注，在動脈粥樣硬化性心血管疾病等涉及治療性血管生成的疾病研究中，被認(rèn)為是最具有臨床治療前景的基因[1-3]。HIF-1由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和組成性表達(dá)的亞單位HIF-1β構(gòu)成，HIF-1α受低氧誘導(dǎo)，決定HIF-1的活性。然而，在常氧狀態(tài)下，HIF-1α容易被降解，而且其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制[4-5]，通過對HIF-1α的Pro402、Pro564位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變可避免HIF-1α的蛋白降解，而對其Asn803位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變可增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[6]。既往研究顯示Pro402、Pro564、Asn803三位點(diǎn)突變型HIF-1α可有效促進(jìn)小鼠或大白兔缺血后肢血管生成[7-8]，然而，臨床上發(fā)生下肢缺血的多為老年人，且常合并有高血壓、糖尿病、血脂異常等動脈硬化危險因素，自身修復(fù)能力差[9-10]，在自身修復(fù)能力較強(qiáng)的幼年或成年動物模型中評價其促血管生成效應(yīng)并不能很好地模擬臨床情況。為更好地模擬臨床情況，本研究將構(gòu)建老年小鼠后肢缺血模型并利用超聲灌注成像、運(yùn)動功能評價及免疫熒光檢查等方法進(jìn)一步評價三突變型HIF-1α的促血管生成效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

六氟化硫超聲微泡(聲諾維，Bracco，瑞士)，生物素標(biāo)記的Bandeiraea Simplicifolia-1(BS-1)凝集素(Sigma，德國)，兔抗人多克隆α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(Abcam，英國)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的親和素(Molecular Probes，美國)，Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam，英國)、Sequoia 512超聲心動圖儀(Siemens，德國)，MCE圖像分析軟件(Cardiovascular Division，University of Virginia Medical Center，美國)。

1.2 動物模型制備及基因轉(zhuǎn)染

昆明小鼠24只，18～20月齡，雄性，30～40 g。實(shí)驗(yàn)小鼠行麻醉后仰臥位四肢固定于鼠板上，雙側(cè)后肢及腹股溝區(qū)備皮，在左側(cè)腹股溝部位切開皮膚后鈍性分離并切斷股動脈及其分支血管[11]，模型制備后，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)等分為3組：腺病毒包裹的β-半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ)組，腺病毒包裹的Pro402、Pro564 雙位點(diǎn)突變型HIF-1α基因(Ad-DM)組，腺病毒包裹的Pro402、Pro564、Asn803三位點(diǎn)突變型HIF-1α基因(Ad-TM)組，分別經(jīng)內(nèi)收肌多點(diǎn)注射溶于0.2 mL生理鹽水的Ad-LacZ、Ad-DM或Ad-TM各4×108OPU。

1.3 對比超聲灌注成像[12]

應(yīng)用對比超聲灌注成像評價小鼠術(shù)前，術(shù)后0、7、14、21、28 d缺血后肢骨骼肌血流灌注情況(缺血后肢/對側(cè)非缺血后肢)。小鼠麻醉并仰臥位四肢固定于鼠板上，尾靜脈插管用于注射超聲微泡。固定超聲探頭(17L5)于小鼠雙側(cè)后肢上，調(diào)整探頭位置獲得良好后肢顯像后保持在整個實(shí)驗(yàn)過程中不變，超聲造影采用二次諧波成像技術(shù)，探頭發(fā)射頻率為7.0 MHz，機(jī)械指數(shù)為0.18，超聲發(fā)射間隔時間設(shè)定為200 ms，儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個實(shí)驗(yàn)過程中保持不變。由尾靜脈持續(xù)注射微泡(5×106個/min)，待骨骼肌充盈達(dá)最大顯影強(qiáng)度后立即給予高機(jī)械指數(shù)2～3 s破壞微泡，采集本底圖像后，持續(xù)超聲造影至骨骼肌達(dá)最大超聲顯影。全部聲學(xué)造影圖像存于CD盤，以備脫機(jī)分析。

1.4 造影圖像血流情況分析

應(yīng)用MCE圖像分析軟件對超聲灌注成像進(jìn)行定量分析，選擇造影前的1幀圖像作為本底圖像，每個時間間隔中選取1幀造影圖像，分別勾畫出骨骼肌感興趣區(qū)。感興趣區(qū)勾畫完畢后，首先由程序自動對所選擇的圖像進(jìn)行排列和對齊，然后再逐一回放每幀圖像，在自動對圖基礎(chǔ)上手工對齊不滿意的圖像。根據(jù)每個興趣區(qū)各時間點(diǎn)的平均視頻強(qiáng)度扣除圖像本底相應(yīng)部位的視頻強(qiáng)度，程序自動繪出不同區(qū)域的觸發(fā)間隔-聲強(qiáng)度曲線，并給出最大微泡數(shù)量(A值)、局部填充速度(β值)和A×β值。后肢骨骼肌蓄積的A值反映的是局部骨骼肌微血管密度，而β值反映的是局部骨骼肌的血流速度，A×β值反映了局部骨骼肌的血流量；將缺血后肢骨骼肌的A×β值和對側(cè)非缺血后肢骨骼肌的A×β值相比得到缺血后肢骨骼肌的血流灌注比值。

1.5 運(yùn)動功能評價

術(shù)后28 d，利用運(yùn)動評分評價各組缺血后肢的運(yùn)動功能，將缺血后肢的運(yùn)動功能分為1～4分，1分：僅可使用腿活動；2分：可使用腳活動；3分：腳活動不受限，腳趾活動部分受限；4分：活動不受限制[13]。

1.6 免疫熒光檢查

術(shù)后28 d超聲灌注成像結(jié)束后，立即處死小鼠并取缺血后肢骨骼肌行BS-1凝集素和α-SMA免疫熒光染色分別標(biāo)記微血管和小動脈。制備5 μm冰凍切片，按操作說明書孵育生物素化標(biāo)記的BS-1凝集素及FITC標(biāo)記的親和素或α-SMA及Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后封片并在顯微鏡下觀察、拍照。每組隨機(jī)挑選5個不相互重疊的視野，計算每個視野的微血管、小動脈及肌纖維個數(shù)，用微血管個數(shù)/肌纖維個數(shù)表示微血管密度，用小動脈個數(shù)/高倍視野表示小動脈密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對比超聲灌注成像

前雙下肢血流量基本相等。術(shù)后0 d，缺血后肢的血流量在Ad-LacZ組、Ad-DM組和Ad-TM組分別為對側(cè)非缺血后肢血流量的(15.1±4.2)%、(16.3±3.7)%和(15.5±3.4)%，三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.811)。隨時間的推移，缺血后肢的血流均有所恢復(fù)，但Ad-TM組的血流恢復(fù)速度明顯快于其他兩組。術(shù)后28 d，Ad-TM組中缺血后肢的血流量達(dá)到對側(cè)非缺血后肢血流量的(67.4±8.1)%，較Ad-LacZ組的(33.2±5.2)%和Ad-DM組的(48.4±5.3)%顯著增加(P<0.001)(見圖1)。

注：和其他組相比，&表示P<0.001。

2.2 運(yùn)動功能評價

術(shù)后28 d，Ad-TM組的運(yùn)動評分(3.4±0.7)分較Ad-LacZ組的(1.8±0.6)分和Ad-DM組的(2.5±0.5)分顯著增加(P=0.001)(見圖2)。

注：和其他組相比，&表示P=0.001。

2.3 免疫熒光染色

術(shù)后28 d，Ad-TM組的微血管(綠色熒光標(biāo)記)密度(3.1±0.6)較Ad-LacZ組的(1.6±0.4)和Ad-DM組的(2.0±0.5)顯著增加(P<0.001)(見圖3)。Ad-TM組的小動脈(紅色熒光標(biāo)記)密度(10.6±2.2)較Ad-LacZ組的(5.7±1.0)和Ad-DM組的(6.7±1.5)顯著增加(P<0.001)(見圖4)。

注:圖A、B、C為不同治療組缺血后肢微血管染色(綠色熒光)的顯微鏡下圖片,標(biāo)尺為50 μm;圖D為微血管密度對比圖。和其他組相比,&表示P<0.001。

注:圖A、B、C為不同治療組缺血后肢小動脈染色(紅色熒光)的顯微鏡下圖片,標(biāo)尺為50 μm;圖D為小動脈密度對比圖。和其他組相比,&表示P<0.001。

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，以及社會人口老齡化趨勢等因素，糖尿病足、下肢動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎等慢性下肢缺血性疾病的發(fā)病率也與日俱增。常規(guī)的藥物、血管旁路移植術(shù)或腔內(nèi)介入等治療方法療效欠佳，患者往往被迫行截肢(趾)手術(shù)，嚴(yán)重影響患者的生存及生活質(zhì)量[14-15]。治療性血管生成的出現(xiàn)，即通過人為地向局部組織輸送血管生長因子基因或重組蛋白的方式促進(jìn)局部缺血組織血管生成，改善組織缺血缺氧及患者預(yù)后，為缺血性心血管疾病的治療提供了新的途徑[16-17]。既往已成功構(gòu)建了腺病毒包裹的不同位點(diǎn)突變型HIF-1α基因，并在體外及在體實(shí)驗(yàn)中證明了不同突變位點(diǎn)突變型HIF-1α基因的促血管生成效應(yīng)[7-8]。然而，在既往的動物實(shí)驗(yàn)中，多采用幼年小鼠或大白兔后肢缺血模型作為研究對象，其自身修復(fù)能力強(qiáng)。而臨床上發(fā)生慢性下肢缺血性疾病的通常為老年人，其血管生成能力隨年齡增大而減弱，且常合并吸煙、高血壓、血脂異常、糖尿病等動脈硬化危險因素，修復(fù)缺血和受損組織的能力明顯減弱[18]。因此，僅在幼年小鼠或大白兔后肢缺血模型上評價突變型HIF-1α的促血管生成效應(yīng)是不充分的，在更符合臨床情況的老年小鼠后肢缺血模型中可更充分地評價它的治療效果。

本研究通過結(jié)扎老年小鼠一側(cè)后肢股動脈構(gòu)建后肢缺血模型，模型構(gòu)建后立即行超聲灌注成像提示缺血后肢血流量僅為對側(cè)非缺血后肢血流量的15%，提示后肢缺血模型構(gòu)建成功，且3組之間的缺血程度相當(dāng)。動態(tài)的超聲灌注成像提示：隨術(shù)后時間的推移，缺血后肢的血流灌注不斷恢復(fù)。利用MCE軟件分析超聲灌注圖像發(fā)現(xiàn)：A值和β值均隨術(shù)后時間的推移而增加，這表明缺血后肢血流的恢復(fù)來源于局部微血管密度的增加以及局部血流速度的加快。

下面將進(jìn)一步從病理學(xué)角度探討其血流恢復(fù)的機(jī)制。在成年期，血管生成主要包括血管發(fā)生和小動脈生成[19]。血管發(fā)生是指從已存在的血管上，通過成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)的過程。它是組織損傷、傷口愈合、組織缺氧等病理情況下的一種代償反應(yīng)。在成人缺血性心血管疾病和腫瘤的缺血缺氧組織中都會有血管數(shù)量的增多，低氧誘導(dǎo)的HIF-1α激活是血管發(fā)生的主要分子機(jī)制[20]。在本研究中，A值隨術(shù)后時間的推移而增大，表明缺血后肢局部微血管密度增加，也說明血管發(fā)生在老年小鼠缺血后肢血流恢復(fù)中擔(dān)當(dāng)重要的角色[11]。且在本團(tuán)隊(duì)的研究中，血流灌注恢復(fù)更好的Ad-TM組其微血管密度明顯高于其他兩組，這表明Ad-TM可有效促進(jìn)老年小鼠缺血后肢的血管發(fā)生。而小動脈生成是固有側(cè)支循環(huán)生成的重要機(jī)制之一，當(dāng)血管發(fā)生阻塞時，側(cè)支血管血流速度加快，管腔切應(yīng)力相應(yīng)增加，側(cè)支血管最終形成較大管徑動脈，即側(cè)支血管的生長[21]。側(cè)支循環(huán)的形成可能是缺血下肢血流恢復(fù)的重要機(jī)制[22]。在本團(tuán)隊(duì)的研究中，β值隨術(shù)后時間的推移而增大，這表明缺血后肢局部血流速度加快，也支持小動脈生成在小鼠缺血后肢血流的恢復(fù)中占據(jù)重要的地位[22]。雖然側(cè)支循環(huán)的形成主要與局部血管的剪切應(yīng)力相關(guān)，然而，炎癥也參與側(cè)支循環(huán)的形成[23]。HIF-1α能促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞的遷移、浸潤和激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成[24]。而且Ad-TM組的小動脈密度明顯高于其他兩組，這表明Ad-TM可通過促進(jìn)小動脈生成/側(cè)支血管形成改善老年小鼠后肢缺血。本團(tuán)隊(duì)推測這可能是在Ad-TM組中，即使在常氧狀態(tài)下，三突變型HIF-1α仍可避免被降解，且轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，大量激活下游血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1、血管生成素-2、胎盤生長因子、血小板衍生生長因子等血管生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、浸潤和激活，以及對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)血管發(fā)生和側(cè)支血管形成的增加，促進(jìn)缺血后肢血流恢復(fù)及運(yùn)動功能改善，病理學(xué)上則表現(xiàn)為微血管及小動脈密度增加，這與既往的研究一致[2]。

綜上所述，三突變型HIF-1α可通過血管發(fā)生和小動脈生成的機(jī)制有效地促進(jìn)老年小鼠缺血后肢血管生成，改善缺血后肢的血流灌注及其運(yùn)動功能。

當(dāng)然，本研究也存在一定局限性，如未進(jìn)一步探討三突變型HIF-1α基因更好地促進(jìn)缺血后肢血管生成的分子機(jī)制，這將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。