魚(yú)類(lèi)內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的研究進(jìn)展

文/丁寧 譚雨青 洪惠 羅永康

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖加工技術(shù)的發(fā)展與國(guó)民膳食結(jié)構(gòu)不斷均衡，消費(fèi)者對(duì)具有優(yōu)質(zhì)蛋白含量高、脂肪含量低等特點(diǎn)的水產(chǎn)品消費(fèi)需求日益增加。魚(yú)丸、魚(yú)糕和模擬蟹肉等魚(yú)糜制品及冷凍調(diào)理食品在水產(chǎn)品加工行業(yè)中占據(jù)著重要地位，此類(lèi)產(chǎn)品風(fēng)味良好、食用方便的特點(diǎn)符合消費(fèi)者需求。但魚(yú)糜制品生產(chǎn)過(guò)程中的凝膠劣化效應(yīng)（Modori effect）使得產(chǎn)品彈性下降、凝膠強(qiáng)度減小，在一定程度上制約了魚(yú)糜產(chǎn)品市場(chǎng)的擴(kuò)大。為闡明魚(yú)糜在加工過(guò)程中凝膠強(qiáng)度下降的原因，早在20世紀(jì)80年代就有學(xué)者對(duì)此展開(kāi)研究，并在魚(yú)肌肉中發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致肌原纖維蛋白降解的非溶酶體蛋白酶——I型蛋白酶（絲氨酸蛋白酶），它能夠在體外降解平滑肌和骨骼肌中的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白。目前研究人員普遍認(rèn)為內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶，即魚(yú)體內(nèi)自身存在的蛋白酶，尤其是肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶是魚(yú)糜凝膠劣化的關(guān)鍵作用酶。

本文對(duì)魚(yú)類(lèi)內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)、分離純化及其抑制劑研究展開(kāi)綜述，并對(duì)目前增強(qiáng)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的方法進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，以期為魚(yú)糜制品的生產(chǎn)加工及其凝膠性能的改善提供理論基礎(chǔ)。

一、內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)

絲氨酸蛋白酶是一類(lèi)堿性蛋白酶家族，包含胰蛋白酶、彈性蛋白酶等多種水解酶，在魚(yú)體生理調(diào)控方面起著重要作用。絲氨酸蛋白酶因其活性絲氨酸殘基Ser195能與底物發(fā)生親和反應(yīng)而得名，其活性部位是由His57、Asp102、Ser195殘基構(gòu)成的催化中心三聯(lián)體，三個(gè)殘基分別位于C端（His195）和N端結(jié)構(gòu)域（Asp 102 &His 57），如圖1所示（由于目前關(guān)于魚(yú)肉中的MBSP研究有限，其三維結(jié)構(gòu)并未完全闡明，因此以胰蛋白為例展示活性中心的結(jié)構(gòu)）。盡管不同絲氨酸蛋白酶在進(jìn)化過(guò)程中一級(jí)序列高度可變，但其核心催化結(jié)構(gòu)相對(duì)保守和穩(wěn)定，具有相同的催化機(jī)制。即絲氨酸蛋白酶的一般特性是通過(guò)激活活性中心進(jìn)行催化，但對(duì)底物具有特異性。

圖1 胰蛋白酶（PDB編號(hào)：1A0J）三維結(jié)構(gòu)示意圖

在魚(yú)類(lèi)肌肉中，絲氨酸蛋白酶以肌漿絲氨酸蛋白酶（Sarcoplasm serine protease，SSP）和肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（Myofibril-bound serine protease，MBSP）兩種形式存在，其中肌漿絲氨酸蛋白酶可經(jīng)漂洗從魚(yú)糜中除去，而肌原纖結(jié)合型絲氨酸蛋白酶與肌原纖維蛋白穩(wěn)固結(jié)合、不易洗脫，不僅能夠分解肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC），且在長(zhǎng)時(shí)間加熱條件下對(duì)原肌球蛋白、輔肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白都有一定程度的降解，因此在凝膠劣化過(guò)程中起主要作用。在大多數(shù)淡水魚(yú)中，MBSP的最適溫度在50℃～55℃，最適pH值介于7.0～8.0，如表1所示。MBSP的分子量因生物種類(lèi)不同而存在明顯差異。在淡水魚(yú)中，MBSP多為28kD左右的單亞基蛋白，在海水魚(yú)中多以同源二聚體形式存在，分子量在30kD～70kD不等。圖2列出了不同內(nèi)源性絲氨酸酶N端氨基酸序列與草魚(yú)胰蛋白酶的序列比對(duì)，它們表現(xiàn)出高度同源性，因此也稱(chēng)MBSP為類(lèi)胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine protease）。

表1 不同魚(yú)類(lèi)中內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的特性

圖2 不同魚(yú)類(lèi)中絲氨酸蛋白酶與胰蛋白酶的N端氨基酸序列比對(duì)

內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶能夠特異性裂解精氨酸殘基的羧基端肽鍵，對(duì)賴(lài)氨酸殘基也有一定水解作用，但不同來(lái)源的絲氨酸蛋白酶的底物特異性略有不同。在水解肽類(lèi)底物時(shí)，只對(duì)特定的堿基對(duì)表現(xiàn)出偏好性，如在單個(gè)堿基的羧基端肽鍵和兩個(gè)連續(xù)堿性殘基（例：Arg-Arg、Lys-Arg）之間的肽鍵中，對(duì)Arg-Arg的水解程度最大；在水解含MCA（7-氨基-4-甲基香豆素）的熒光底物中，傾向于水解Arg或Lys的羧基端肽鍵。這些現(xiàn)象表明底物的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)絲氨酸蛋白酶的降解率有重要影響。如表2所示，P1位置（從底物水解位點(diǎn)起，從C端至N端方向的氨基酸位點(diǎn)依次為P1、P2、P3等）為Arg的底物一般對(duì)鯉魚(yú)MBSP的親和力更高，P2處的殘基種類(lèi)變換產(chǎn)生的影響則較小。需要說(shuō)明的是，由于脯氨酸導(dǎo)向的精氨酸裂解作用（Proline-directed arginyl cleavage），P2位置是Pro的底物對(duì)MBSP的親和力更高。而P3位點(diǎn)的氨基酸殘基類(lèi)型會(huì)嚴(yán)重影響該酶對(duì)底物的水解活性，特別是P3位點(diǎn)為Gly時(shí)，幾乎不被MBSP所水解。

表2 鯉魚(yú)MBSP的底物特異性

二、內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的分離純化

關(guān)于內(nèi)源性蛋白酶在凝膠降解中的作用在早些時(shí)候已被許多研究者所明確，但長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為發(fā)揮作用的是一類(lèi)熱穩(wěn)定堿性蛋白酶（Heatstable alkaline protease，HAP）。最早，Kinoshita從金線魚(yú)（）中分離出一種能夠有效降解肌球蛋白重鏈且不同于HAP的蛋白酶。主要方法是以背部肌肉勻漿后的上清液作為粗酶液，然后經(jīng)過(guò)DEAE-cellulose柱、Con A-Sepharose柱和Arginine-Sepharose柱層析純化至電泳級(jí)純度。研究結(jié)果表明該酶是一種絲氨酸蛋白酶，在中性pH范圍、50℃～70℃下具有對(duì)MHC的降解活性，并表現(xiàn)出類(lèi)胰蛋白酶的底物特異性。隨后，關(guān)于SSP的分離純化主要是通過(guò)硫酸銨沉淀法，如Cao等在白姑魚(yú)（）、Liu等在金線魚(yú)（）中的分離方法。SSP在當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是凝膠降解的主要原因，而Toyohara發(fā)現(xiàn)肌漿與肌原纖維中所含凝膠降解因子（Gel degradation-inducing factor，GIF）對(duì)凝膠的降解效果在不同魚(yú)種中有明顯不同，但洗去肌漿的肌原纖維凝膠降解更為嚴(yán)重，這也說(shuō)明肌原纖維本身具有的GIF才是凝膠劣化現(xiàn)象主要因素。

1997年，Osatomi等首次在鯉魚(yú)（）肌肉肌原纖維中分離純化出MBSP，所采用的方法是首先提取出肌原纖維蛋白，置于高濃度鹽溶液、酸性條件下分離MBSP，所得粗提液先后經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析和親和柱層析純化，得到電泳級(jí)純度MBSP，分離純化流程見(jiàn)圖3。此后，其他淡水魚(yú)中的MBSP都陸續(xù)得到分離純化。Cao在酸性條件下（pH4.0）分離出鰱魚(yú)MBSP，超濾濃縮后通過(guò)Sephacryl S-200、High-Q離子交換柱和Arginine Sepharose-4B層析柱進(jìn)行純化。由于淡水魚(yú)和海水魚(yú)中MBSP的一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及與肌原纖維的結(jié)合方式不盡相同，提取海水魚(yú)的方法需要在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。2000年，Cao從狗母魚(yú)（）中分離出肌原纖維，在pH6.0、55℃加熱條件下處理5min得到粗酶液，先后通過(guò)陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、羥基磷灰石層析和親和層析進(jìn)行純化得到MBSP。同樣是在狗母魚(yú)中，Ohkubo對(duì)該方法進(jìn)行了一些改動(dòng)，得到活性更高的MBSP。所采用的方法是在相同條件下（pH6.0，55℃）得到粗酶液后凍干，溶解于1M KCl溶液后透析，與乙醇按照7:3的比例混合、離心后取上清液，再次透析后依次進(jìn)行Q-sepharose柱、Phenyl Sepharose CL-4B柱純化。

圖3 分離內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶流程圖

三、魚(yú)類(lèi)絲氨酸蛋白酶的抑制劑研究

目前，許多食品添加劑、酶制劑及新型加工技術(shù)等陸續(xù)應(yīng)用于魚(yú)糜制品的生產(chǎn)，以提高產(chǎn)品的凝膠性能，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑的添加能夠顯著抑制內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的活性從而改善凝膠劣化現(xiàn)象。已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine protease inhibitor，SPI）包括天然抑制劑和小分子化學(xué)制劑。天然絲氨酸蛋白酶抑制劑存在于動(dòng)植物及微生物中，是能夠引起酶活力下降的蛋白或肽，一般以具有抑制活性的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象存在，當(dāng)與靶酶結(jié)合后結(jié)構(gòu)重排，形成非常穩(wěn)固的共價(jià)復(fù)合物，不可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制靶酶活性。對(duì)于魚(yú)類(lèi)中的絲氨酸蛋白酶來(lái)說(shuō)，可根據(jù)是否來(lái)源于魚(yú)體分為外源性抑制劑和內(nèi)源性抑制劑。

（一）外源性抑制劑

胰蛋白酶抑制劑是常見(jiàn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑種類(lèi)之一，通過(guò)自身的P1位點(diǎn)與胰蛋白酶的活性中心以氫鍵等作用力結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。豆類(lèi)中富含胰蛋白酶抑制劑，分為Kunitz型和Bowman-Brik型，后者因其特殊的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的二硫鍵而具有更高的蛋白酶抑制活性和耐熱性，更受研究者青睞。國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道將豆類(lèi)胰蛋白酶抑制劑（Soybean trypsin inhibitor，SBTI）用于提升魚(yú)糜品質(zhì)，結(jié)果顯示加入大豆蛋白酶抑制劑、綠豆蛋白酶抑制劑等的處理組與對(duì)照組相比，抑制肌原纖維蛋白降解、增強(qiáng)保水能力與凝膠強(qiáng)度效果顯著，這也有力證實(shí)了絲氨酸蛋白酶參與了魚(yú)糜凝膠劣化過(guò)程。除了加入魚(yú)糜中，豆類(lèi)胰蛋白酶抑制劑也能夠作用于其他水產(chǎn)品中的內(nèi)源性絲氨酸酶，抑制其肌肉軟化。

此外，常見(jiàn)的化學(xué)制劑類(lèi)絲氨酸蛋白酶抑制劑有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽（Pefabloc SC）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶、乙二胺四乙酸（EDTA）以及N-甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酸-氯甲基酮（TLCK）等。在大部分研究中，Pefabloc SC、TLCK都能夠抑制魚(yú)類(lèi)內(nèi)源性絲氨酸酶80%以上的活性，而PMSF、EDTA及半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64的抑制率根據(jù)絲氨酸蛋白酶的來(lái)源和存在部位略有不同，混合型抑制劑相比單個(gè)抑制劑有著更好的抑制效果。

此前，還有研究從牛血漿蛋白、馬鈴薯淀粉等物質(zhì)中提取絲氨酸蛋白酶抑制劑來(lái)抑制魚(yú)糜凝膠劣化，但其對(duì)產(chǎn)品顏色和風(fēng)味造成影響限制了實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用。

（二）內(nèi)源性抑制劑

近年來(lái)，該領(lǐng)域的研究開(kāi)始側(cè)重于從魚(yú)類(lèi)自身的肌肉或其他器官中提取出特異針對(duì)某一絲氨酸蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑。Cao等首次從白姑魚(yú)中發(fā)現(xiàn)一種新型的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑（MBSPI），通過(guò)序列測(cè)定、酶學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)該MBSPI實(shí)際上是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose phosphate isomerase，GPI）。類(lèi)似的，鯽魚(yú)GPI也能夠特異性抑制自身MBSP，動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示抑制類(lèi)型為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制，見(jiàn)圖4。隨后，狗母魚(yú)中的MBSPI也得到分離純化，能夠顯著抑制狗母魚(yú)的MBSP，但在對(duì)其他酶（SSP、鯉魚(yú)MBSP、牛胰蛋白酶等）的抑制中表現(xiàn)出高度的特異性，即用高濃度的MBSPI處理時(shí)，鯉魚(yú)MBSP的活性并未受到明顯影響。研究人員推測(cè)這可能與淡水魚(yú)、海水魚(yú)MBSP的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。除與抑制劑結(jié)合的活性中心可能不同以外，其他位點(diǎn)也可能在空間上影響MBSPI與酶的相互作用。近年，還有研究者從魷魚(yú)卵巢中提取出SPI，以2%比例添加到印度鯖魚(yú)魚(yú)糜中，能夠提高魚(yú)糜的凝膠性能，且不造成負(fù)面感官影響。這類(lèi)天然SPI可以替代提高凝膠強(qiáng)度的添加劑，在食品加工中有很大應(yīng)用潛力。

圖4 競(jìng)爭(zhēng)性抑制示意圖

四、總結(jié)與展望

魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度一直是影響產(chǎn)品適口性和消費(fèi)者接受程度的重要因素，目前已確認(rèn)內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶是參與魚(yú)類(lèi)肌原纖維降解的重要酶類(lèi)之一，特別是在魚(yú)糜加工中絲氨酸蛋白酶對(duì)凝膠劣化的作用最為顯著，同時(shí)也是導(dǎo)致冷藏期間的魚(yú)類(lèi)或其他水產(chǎn)品肉質(zhì)軟化的原因之一。通過(guò)添加適當(dāng)?shù)囊种苿﹣?lái)降低魚(yú)糜等水產(chǎn)品中的內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶活性，可以顯著提升產(chǎn)品品質(zhì)，其結(jié)合脂質(zhì)、多糖等外源物添加以及超高壓、微波加熱等物理場(chǎng)技術(shù)，是未來(lái)改善凝膠性能的主要研究方向。雖然關(guān)于絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究已經(jīng)十分廣泛，但對(duì)內(nèi)源性抑制劑的結(jié)構(gòu)特性及作用機(jī)制還有待繼續(xù)探索，期望下一步通過(guò)基因克隆、重組表達(dá)等手段開(kāi)發(fā)新型特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑應(yīng)用于魚(yú)糜等水產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。