單硝酸異山梨酯緩釋片中硝酸鹽含量的檢測方法

李 琳，楊書娟，王 雪，竇艷麗，李 梅，徐玉文

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，仿制藥研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心 山東 濟(jì)南 250101）

心絞痛發(fā)病會導(dǎo)致缺氧性供血不足，近年臨床發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[1-2]。單硝酸異山梨酯是治療心絞痛和充血性心力衰竭的常用藥物[3-4]，也是臨床上常用的心臟病治療藥物[5-9]，其治療效果較理想，可對心臟形成長期保護(hù)，減少損傷[10]。單硝酸異山梨酯緩釋片能顯著修復(fù)心臟的舒張功能，增加患者的活動耐量，并明顯降低患者的激素水平[11]；還可改善患者的心肌血液供應(yīng)量，進(jìn)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞的功能，起到改善患者心功能的治療效果[12-13]。該藥物的特點(diǎn)是藥效持續(xù)時間長，用藥量低；藥理研究表明，小劑量給藥即能起到擴(kuò)張靜脈血管的作用，同時能提升心臟平滑肌的收縮能力[14-15]。單硝酸異山梨酯是異山梨醇與硝酸鹽酯化反應(yīng)所得[16-17]，硝酸鹽原料在精制中會有部分殘留，對藥品安全性產(chǎn)生影響。查閱國內(nèi)外的藥典標(biāo)準(zhǔn)，單硝酸異山梨酯片中硝酸鹽的含量檢測采用薄層色譜檢查法。薄層色譜法由于檢測靈敏度較低，還無法準(zhǔn)確定量，有一定缺陷。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）和離子色譜法（IC）兩種檢測方法，建立單硝酸異山梨酯緩釋片中硝酸鹽的含量測定方法，為更好控制單硝酸異山梨酯緩釋片的質(zhì)量提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；ICS-5000離子色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；CP225D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

硝酸鉀（批號：20181221，濃度：含硝酸根61 %）、磷酸氫二鉀（分析純，批號：20161129）、氫氧化鉀（分析純，批號：20160106）、磷酸（分析純，批號：20200731）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），硝酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級計量站，批號：20181218，濃度：1000 μg/ml），甲醇（康科德，色譜純，批號：Q/12KKDT001-2018），水為去離子水；樣品單硝酸異山梨酯緩釋片由A企業(yè)（批號：1133），B企業(yè)（批號：3699）提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

2.1.1 色譜條件 色譜柱：采用Kromasil 100A C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃，流動相為以0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.3）為流動相A，以甲醇為流動相B，照表1進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 ml/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量20 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 樣品制備

2.1.2.1 供試品溶液制備 精密稱取單硝酸異山梨酯緩釋片：0.2170 g（批號：1133），0.3140 g（批號：3699），分別置入25 ml量瓶，加水適量，振搖（200 r/min）6 h使溶解，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取硝酸鉀53.82 mg，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 ml，置入100 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.3.1 專屬性考察 分別取2.1.2項(xiàng)下的供試品溶液、對照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果硝酸根離子峰在2.3 min有較好峰形，表明方法專屬性良好，見圖1～3。

圖1 硝酸根對照品HPLC色譜圖

圖2 硝酸根樣品HPLC色譜圖

圖3 硝酸根空白對照HPLC色譜圖

2.1.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取硝酸鉀25.74 mg，置入500 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。取對照品貯備溶液適量，加水制成每1 ml分別含0.94，1.88，4.71，7.54，9.42 μg的溶液。分別精密量取上述溶液各20 μl注入液相色譜儀，以對照品溶液峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（x）為橫坐標(biāo)線性回歸，線性回歸方程：A=115 287x+5283.9，R2=1；表明擬定的色譜條件下，硝酸根在0.94～9.42 μg/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.3 檢出限與定量限 取對照品溶液，逐級稀釋，當(dāng)S/N為10時，硝酸根的定量限為19.7 ng/ml；當(dāng)S/N為3時，硝酸根的檢測限為5.91 ng/ml。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取A企業(yè)樣品（批號1133），按2.1.2.1項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，硝酸根平均含量為0.027 %，RSD為1.52 %。

2.1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別于0，4，10，36 h測定，硝酸根峰面積的RSD為1.64 %，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.6 儀器精密度 取對照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄硝酸根峰峰面積，其RSD為0.25 %，表明儀器精密度良好。

2.1.3.7 準(zhǔn)確度 精密稱取硝酸鉀25.74 mg，置入200 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密稱取未檢出硝酸鹽的樣品輔料6份（約相當(dāng)于單硝酸異山梨酯40 mg），分別置入25 ml量瓶，分別向其中精密加入對照品貯備液1 ml，加水適量，振搖（200 r/min）6 h使溶解，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積。計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 HPLC硝酸根回收率結(jié)果（n=6）

2.1.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和2個供試品溶液各20 μl，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測定，按外標(biāo)法計算兩批樣品中硝酸鹽的含量，分別為0.02 %和0.02 %。

2.2 離子色譜法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：采用烷醇季銨基為功能以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為填充劑[IonPacTMAS19（4 mm×250 mm）]陰離子色譜柱；流動相為0.015 mol/L氫氧化鉀溶液，流速為1.0 ml/min，抑制電導(dǎo)檢測（外接水模式），柱溫30 ℃，檢測池溫度35 ℃，進(jìn)樣量25 μl。

2.2.2 樣品制備

2.2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取單硝酸異山梨酯緩釋片0.1102 g（批號：1133），0.1570 g（批號：3699），分別置入25 ml量瓶，加乙腈-水（80:20）20 ml，超聲10 min使單硝酸異山梨酯溶解，放冷至室溫，再用乙腈-水（80:20）稀釋至刻度，搖勻，以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，精密量取上清2 ml，置入10 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)離子色譜前處理柱處理后進(jìn)樣。

2.2.2.2 對照品溶液制備 精密量取硝酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 ml，置入100 ml量瓶，用乙腈-水（16:84）稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置入20 ml量瓶，用乙腈-水（16:84）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別取2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液與對照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果硝酸根離子峰理論板數(shù)符合要求，與其他各色譜峰分離度良好，該方法專屬性良好，結(jié)果見圖4～6。

圖4 硝酸根對照品離子色譜圖

圖5 硝酸根樣品離子色譜圖

圖6 硝酸根空白對照離子色譜圖

2.2.3.2 線性關(guān)系考察 分別取硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 ml，置入100 ml量瓶，用乙腈-水（16:84）稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置入20 ml量瓶，用乙腈-水（16:84）稀釋至刻度，搖勻，即得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密量取各25 μl，分別注入離子色譜儀，記錄色譜圖；以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（x）為橫坐標(biāo)線性回歸，線性回歸方程：A=0.1516x-0.0138，R2=0.9993；表明擬定的色譜條件下，硝酸根在0.1～10 μg/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.3 檢出限與定量限 取對照品溶液，逐級稀釋，當(dāng)S/N為10時，硝酸根的定量限為30 ng/ml；當(dāng)S/N為3時，硝酸根的檢測限為10 ng/ml。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取A企業(yè)樣品（批號1133）按2.2.2.1項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，硝酸根平均含量為0.027 %，RSD為1.52 %。

2.2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件分別于0，4，8，12，24 h測定，硝酸根峰面積的RSD為4.39 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.6 儀器精密度 取對照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄硝酸根峰峰面積，其RSD為0.56 %，表明儀器精密度良好。

2.2.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取未檢出硝酸鹽的樣品輔料（約相當(dāng)于單硝酸異山梨酯20 mg）共9份，分別置入25 ml量瓶，精密加入對照品溶液（濃度為5 μg/ml）0.5，2.5，5 ml，加乙腈-水（80:20）20 ml，超聲10 min使單硝酸異山梨酯溶解，放冷至室溫，再用乙腈-水（80:20）稀釋至刻度，搖勻，4000 r/min離心10 min，經(jīng)離子色譜前處理柱處理后進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 IC硝酸根回收率結(jié)果（n=3）

2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和2個供試品溶液各25 μl，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計算兩批樣品中硝酸鹽的含量，分別為0.02 %和0.03 %。

3 討論

采用IC檢測時，空白對照在進(jìn)樣時在硝酸根峰處出現(xiàn)了干擾，多次進(jìn)樣均不能消除干擾。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的硝酸根對試驗(yàn)可能存在干擾，即采用新制的去離子水濾膜過濾進(jìn)樣，結(jié)果顯示空白對照中未檢測出硝酸根峰。

綜合兩種檢測方法，采用離子色譜法檢測時，試驗(yàn)過程要考慮各方面離子的干擾，要求更細(xì)致，高效液相色譜法則相對簡單。

4 結(jié)論

本文分別建立HPLC和IC檢測單硝酸異山梨酯緩釋片中硝酸鹽含量的方法，由結(jié)果可見，兩種方法測定的硝酸鹽含量無差別。IC廣泛用于無機(jī)陰、陽離子和有機(jī)離子測定，相比薄層色譜法具有靈敏度高，選擇性好，易實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)[18]。HPLC由于分析速度快，分離效率高，檢測靈敏度高，檢測自動化，適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在藥物分析分析中有廣泛的應(yīng)用[19]。兩種檢測方法檢測單硝酸異山梨酯緩釋片中硝酸鹽的含量，均達(dá)到檢測目的，均具有專屬性強(qiáng)，分離度、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。通過方法學(xué)驗(yàn)證，兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)，且簡單，為單硝酸異山梨酯緩釋片的質(zhì)量控制提供了技術(shù)方法，也為不同生產(chǎn)廠家該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。