基于GC-MS及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的腫痛洗劑作用機制研究

李勝群,李昕,陳璐晶,豐培學(xué)*，劉紅兵*

(1.臨沂市中醫(yī)醫(yī)院,山東 臨沂 276000;2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003)

痔是最常見的肛腸外科疾病，在我國發(fā)病率占所有肛腸疾病的87.25%[1]，城市居民痔的發(fā)病率高達(dá)50.28%[2]，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。手術(shù)治療是《中國痔病診療指南(2020)》推薦的治療方法之一，效果明確、成功率較高，但術(shù)后發(fā)生創(chuàng)面感染、水腫、疼痛的概率較高[3-5]。中藥熏洗坐浴法能夠直接對術(shù)后創(chuàng)面進(jìn)行藥物處理，發(fā)揮藥力與熱力作用，可消除水腫，緩解疼痛，利于患者康復(fù)，是值得臨床推廣應(yīng)用的肛腸科術(shù)后治療方法[3-6]。腫痛洗劑是臨沂市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由蒼術(shù)、黃柏、薏苡仁、龍膽、大黃、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草、防風(fēng)等11味藥組成，能清熱燥濕、活血化瘀、消腫止痛，通過熏、洗、坐浴來治療痔瘡術(shù)后的疼痛、水腫、創(chuàng)面滲液等癥，療效頗佳，但藥效物質(zhì)及作用機制不清。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析腫痛洗劑的揮發(fā)性成分，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其消炎止痛的作用機制，以期為臨床使用及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Trace 1300/ISQ型GC-MS聯(lián)用儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司)；HGC-24A型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；AL204-IC型電子天平(瑞士梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料 腫痛洗劑(批準(zhǔn)文號：魯藥制字Z20160025；產(chǎn)品批號：20220118)，山東省臨沂市中醫(yī)院配制。乙醚為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 量取10 mL腫痛洗劑，用等體積乙醚萃取，共3次；合并有機相，氮氣吹干后，用2 mL乙醚溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供GC-MS分析。

2.2 GC-MS條件 色譜條件：色譜柱為 Thermo TG-5MS(30 m × 0.25 mm,0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度250 ℃；爐溫150 ℃；載氣為氦氣，流速為 1 mL·min-1，采用不分流模式；手動進(jìn)樣，進(jìn)樣體積 1 μL。程序升溫：初溫 70 ℃，保持1 min；然后以3 ℃·min-1速率升至 200 ℃，再以5 ℃·min-1速率升至 250 ℃，最后以 10 ℃·min-1速率升至300 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度280 ℃，電離能為70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～600 m/z，溶劑延遲時間5 min。

2.3 數(shù)據(jù)采集和分析 采用 Xcalibur 工作站對GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，利用IXCR軟件對色譜峰進(jìn)行對齊和解卷積處理。采用NIST 11.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物檢索(設(shè)置匹配度>800)；同時利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)以及臺灣中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(http://tcm.cmu.edu.tw/index.php)，分別以蒼術(shù)、黃柏、薏苡仁、龍膽、大黃、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草和防風(fēng)等為關(guān)鍵詞檢索其中的化學(xué)成分，綜合鑒定腫痛沖劑中的揮發(fā)性成分。采用峰面積歸一化法計算化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4 成分靶點搜集 利用TCMSP和Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubch-em.ncbi.nlm.nih.gov/)，檢索腫痛沖劑中揮發(fā)性成分(相對含量大于0.5%)的靶點，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(http://STRING-db.org/cgi/input.pl，限制為Homo sapiens)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換；使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得化合物smile號，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測靶點。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)進(jìn)行靶點合并、去重和標(biāo)準(zhǔn)化。

2.5 消炎止痛相關(guān)靶點篩選 以疼痛(pain)和炎癥(inflammation)為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索，以Gift≥30為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選相關(guān)基因。

2.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，繪制化合物靶點與消炎止痛靶點的韋恩圖；將所得交集靶點導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)置最小交互值(minimum required interaction score)為“highest confidence>0.4”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系節(jié)點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(Node)代表靶點，邊(Edge)代表它們之間的聯(lián)系。將分析結(jié)果以 TSV 格式導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0 軟件中，基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選度值(degree)大于平均數(shù)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)均大于中位數(shù)的靶點，獲得核心靶點蛋白。

2.7 核心靶點富集分析 利用David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對核心靶點進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析，以P<0.05，F(xiàn)DR<0.05作為篩選指標(biāo)，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.8 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)GC-MS鑒定的揮發(fā)性成分、消炎止痛核心靶點和代謝通路，使用 Cytoscape 3.6.0軟件中merge功能，構(gòu)建腫痛洗劑的“成分-靶點-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(Node)代表成分、靶點以及通路，邊(Edge)代表它們之間的聯(lián)系。

3 結(jié)果

3.1 腫痛洗劑的揮發(fā)性成分 腫痛洗劑的GC-MS色譜圖見圖 1，化合物鑒定結(jié)果見表1。共鑒定出53個化合物，占總揮發(fā)性成分的82.54%，有62.33%的化合物確定了處方藥味來源。

圖1 腫痛洗劑揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖

表1 腫痛洗劑揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定結(jié)果

3.2 腫痛洗劑主要揮發(fā)性成分的作用靶點及消炎止痛相關(guān)靶點 在腫痛沖劑的揮發(fā)性成分中，相對含量大于0.5%的化合物共計26個，涉及靶點502個；獲得消炎止痛相關(guān)的靶點6 927個。繪制韋恩圖(見圖2)，得到MAOB、MAOB、ADH1B、ADH1C、ADH1A、LYZ等432個交集靶點，為腫痛洗劑消炎止痛的潛在靶點。

圖2 腫痛洗劑主要揮發(fā)性成分與消炎止痛相關(guān)靶點的韋恩圖

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，獲得432個節(jié)點，7 743條邊，平均節(jié)點度值為35.8，平均局部聚類系數(shù)為0.454；互作靶點與隨機相似靶點組合對比具有顯著差異(P<1.0×10-16)?；诰W(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選得到127個核心靶點，degree由高到低依次為TNF、IL-6、INS、TP53、CTNNB1、IL-1β、VEGFA、MAPK3等(見圖4)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖4 基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c排序(degree排名前20)

3.4 靶點富集分析 對127個核心靶點蛋白進(jìn)行GO分析，共富集到414個生物學(xué)過程、56個細(xì)胞組分、90個分子功能。結(jié)果提示，生物過程主要富集在基因表達(dá)正負(fù)調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、正調(diào)控MAP激酶活性、細(xì)胞凋亡正負(fù)調(diào)控、應(yīng)對缺氧的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等(見圖5A)；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞質(zhì)、膜筏、胞漿核周區(qū)、質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)等(見圖5B)；分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合等(見圖5C)。

圖5 GO分析直方圖(TOP10)

KEGG富集分析涉及163條信號通路，分析排名前30的通路(見圖6)，發(fā)現(xiàn)與腫痛洗劑藥理作用相關(guān)的有HIF-1、PI3K-Akt、IL-17 等3條關(guān)鍵信號通路。

圖6 KEGG分析氣泡圖(TOP30)

3.5 構(gòu)建“成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò) 使用 Cytoscape 3.6.0 軟件，基于主要化合物、核心靶點、關(guān)鍵信號通路及其三者之間的連接度，構(gòu)建腫痛洗劑“成分-靶點-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)。節(jié)點大小代表節(jié)點degree值大小，表示該成分與作用靶點的關(guān)聯(lián)個數(shù)，degree值越大說明該成分越重要，共有156個節(jié)點，1 199條邊。由圖7可知，在26個主要化合物中，阿魏酸、大黃酚、鄰苯二甲酸二丁酯、大黃素、(+)-匙葉桉油烯醇、棕櫚酸、地奧酚、大黃素甲醚等8個化合物有較高的連接度；在127個核心靶點中，PTGS2、MAOB、ESR2、PPARG、PTPN1、EGFR、MAP2K1、IL-6、TNF等靶點的連接度高于其他靶點；3條關(guān)鍵信號通路縫隙連接的連接度基本相當(dāng)，其中以PI3K-Akt 信號通路相對較高。以上結(jié)果提示，腫痛洗劑是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用達(dá)到發(fā)揮治療作用。

圖7 腫痛洗劑主要揮發(fā)性成分-消炎止痛核心靶點-關(guān)鍵信號通路圖(藍(lán)色代表腫痛洗劑主要揮發(fā)性成分，綠色代表核心靶點，黃色代表關(guān)鍵通路)

4 討論

腫痛洗劑是院內(nèi)制劑，用于痔瘡手術(shù)術(shù)后常見的疼痛、創(chuàng)面水腫感染等癥。該方由蒼術(shù)、黃柏、薏苡仁、龍膽、大黃、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草、防風(fēng)等11味藥組成，清熱燥濕、活血化瘀、消腫止痛。本研究運用GC-MS法鑒定了53個揮發(fā)性化合物，其中花椒油素(xanthoxylin)相對含量最高。文獻(xiàn)表明，花椒油素可抑制血小板凝聚，抑制藥物引起的腸、子宮、膀胱等肌肉收縮，具有驅(qū)蟲、殺菌、防霉、抗炎的功效[7]。通過構(gòu)建“主要成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)阿魏酸、大黃酚、大黃素是腫痛洗劑重要的藥效成分。阿魏酸源于黃柏，能抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂及抗血栓[8]；大黃酚和大黃素都是源于方中大黃的蒽醌類化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、保肝降脂、抗纖維化等作用[9]。

通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)得到的關(guān)鍵核心靶點中，TNF可通過激活T細(xì)胞免疫活性參與免疫應(yīng)答，具有殺傷轉(zhuǎn)化細(xì)胞和某些病毒感染的細(xì)胞的能力[10]。IL-6具有促炎活性，在呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等炎癥反應(yīng)中起重要作用[11]。TP53通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與炎癥反應(yīng)過程[12]；CTNNB1可以編碼β-catenin，后者在自身免疫性疾病、炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[13]。PTGS2是構(gòu)建的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中顯著性最高的核心靶點，其在 IL-1β、TNF 等促炎因子刺激下產(chǎn)生前列腺素-2(PGE-2)，繼而誘導(dǎo)局部白細(xì)胞聚集，加重炎癥反應(yīng)[14]。

通過富集KEGG通路分析可知，腫痛洗劑主要通過調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、IL-17 等信號通路等發(fā)揮治療作用。HIF-1是干預(yù)炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凋亡、腫瘤的重要信號通路[15]。PI3K-AKT通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化、遷移等生理過程，具有促進(jìn)細(xì)胞成活、抗炎及抗凋亡的作用[16]。IL-17 是一個重要的促炎癥細(xì)胞因子，其信號通路與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。

綜上，本研究運用GC-MS法鑒定了腫痛洗劑的揮發(fā)性成分，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其消炎止痛的藥效成分、作用靶點及通路進(jìn)行了預(yù)測和討論，為其臨床使用及質(zhì)量控制提供參考。