CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在豬育種中的研究進展

許美娜，朱奕舟，林思遠，陳瑤生，何祖勇

（中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510006）

《中國畜禽遺傳資源志·豬志》記載現(xiàn)代家豬的祖先是古代野豬?？茖W家們研究眾多地區(qū)不同豬種的線粒體D-loop 區(qū)序列多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，東南亞擁有最古老的野豬群體，它們逐漸分散至不同地區(qū)，隨著自然條件的改變以及人工選擇，野豬的習性、體態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機能等逐漸發(fā)生變化，最終形成家豬［1］。至今家豬已成為最重要的家畜之一［2］。我國人工馴化野豬歷史悠久，各地區(qū)勞動人民結(jié)合當?shù)氐淖匀粭l件、風俗習慣和社會經(jīng)濟條件培育出眾多具有地方特色的豬種，使我國成為世界上豬種資源最為豐富的國家。目前已有76 個地方豬種收錄于《中國畜禽遺傳資源志·豬志》。我國的地方豬品種具有肉質(zhì)細嫩、肌纖維細、肌內(nèi)脂肪含量高等優(yōu)良肉質(zhì)性狀，但存在生長緩慢、早熟易肥、瘦肉率低、飼料轉(zhuǎn)化率低等缺點［3］。而西方瘦肉型豬具有生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高等優(yōu)點，正好可以彌補我國地方豬種的缺點。因此，利用西方瘦肉型豬種進行雜交可以有效改良我國地方豬種的生長及瘦肉率等性狀，但同時也對其肉質(zhì)性狀造成不利影響。而基因編輯技術(shù)可對目標性狀進行精確修飾，并可避免對其他重要經(jīng)濟性狀帶來不利影響，同時還可以減少傳統(tǒng)雜交因世代間隔和級進雜交選育的耗時，能在最短的時間內(nèi)得到符合生產(chǎn)需求的突破性改良品種，實現(xiàn)豬個體和群體水平的“基因編輯育種”［4］。

基因編輯技術(shù)是一種可以對生物體基因組DNA 進行特異性識別并定點修飾的技術(shù)［5］。通過人工核酸酶定點切割DNA 雙鏈，依靠細胞自身的修復(fù)機制，可以對生物個體的基因組進行基因敲除、敲入和堿基替換等一系列人工修飾，實現(xiàn)基因序列的改變。目前，基因編輯技術(shù)可分為三代：第一代利用鋅指核酸酶（Zinc Finger Nucleases,ZFN）。ZFN 由鋅指蛋白（Zinc Finger Protein,ZFP）組成的DNA 識別結(jié)合域和具有限制性內(nèi)切酶活性的FokⅠ組成的DNA 切割域兩部分組成。其中DNA 識別結(jié)合域賦予ZFN結(jié)合特異性，使其基因組在特定靶位點上結(jié)合，而非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ則發(fā)揮切割功能，使靶序列的雙鏈斷裂（Double Strand Break,DSB）［6］。第二代利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN）。TALEN 的構(gòu)造與ZFN 類似，由TALE 基序串聯(lián)成決定靶向性的DNA 識別模塊，與FokⅠ結(jié)構(gòu)域連接而成［7］。與鋅指基序不同，1 個TALE 基序識別1 個堿基對，因此串聯(lián)的TALE 基序與所識別的堿基對是一一對應(yīng)的關(guān)系，使設(shè)計TALEN 比設(shè)計ZFN 更為簡易［8］。第三代利用常間回文重復(fù)序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas，CRISPR/Cas）系統(tǒng)［9］。三者都是通過人工核酸酶對基因組中特定位置產(chǎn)生斷裂缺口，誘導(dǎo)生物體對受損DNA 進行修復(fù)，從而產(chǎn)生突變。但前兩項技術(shù)因成本高、操作復(fù)雜等特點而發(fā)展受限；而CRISPR/Cas 系統(tǒng)因構(gòu)造簡潔，操作簡便，編輯效率高且可以進行多個位點修飾而被廣泛使用［10］。因此，本文主要介紹CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展及其在家豬遺傳改良中的研究進展，以期加深人們對基因編輯技術(shù)在家豬遺傳育種中具有特殊作用的認識。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

1.1 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas 是一種古細菌的天然免疫系統(tǒng)［11］該系統(tǒng)由CRISPR 序列與CAS（CRISPR associate system）兩部分組成。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為Type Ⅰ、Type Ⅱ和Type Ⅲ 3 種類型［9］Type Ⅱ因其簡易性和可操作性被開發(fā)成為使用最廣泛的基因編輯工具——CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 來源于釀膿鏈菌的SF370 菌株。Cas9 蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，包含RuvC 和HNH 兩個具有DNA 切割活性的結(jié)構(gòu)域，在CRISPR RNA（crRNA）與反式激 活crRNA（Trans-activating crRNA,tracrRNA）復(fù)合體的引導(dǎo)下，Cas9 蛋白結(jié)合到靶序列上，HNH 結(jié)構(gòu)域切割與crRNA 配對的單鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域則切割crRNA 的非互補單鏈，最終造成DSB［12］（圖1A）。DNA 雙鏈斷裂后可引起非同源末端連接（Non-Homologous End Joining,NHEJ）或者同源重組修復(fù)（Homology-Directed Repair,HDR）。NHEJ 修復(fù)的過程中往往會產(chǎn)生小片段DNA 的插入或刪除（Insertion and deletion,Indel），造成移碼突變，致使基因功能喪失，從而實現(xiàn)基因敲除；在攜帶目標突變供體模板的情況下，細胞可通過HDR 機制實現(xiàn)定點突變或插入。為了方便操作，目前普遍使用crRNA 和tracrRNA嵌合一起的單鏈向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）來引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9 結(jié)合到基因組的特定位點進行切割，以實現(xiàn)基因編輯目的（圖1B）。

圖1 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)［9］Fig.1 CRISPR-Cas9 gene editor system［9］

目前CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在人類疾病模型構(gòu)建和畜禽遺傳改良等領(lǐng)域已產(chǎn)生重要的推動作用，但研究應(yīng)用過程中也發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的一些缺點：Cas9 核酸酶對特異性靶位點進行切割后，在DSB 修復(fù)過程中，HDR 在與NHEJ 進行競爭時往往占優(yōu)勢，因此基因編輯結(jié)果基本上是Indel造成的基因敲除，而難以獲得HDR 介導(dǎo)的點突變。對于大多數(shù)已知的遺傳疾病和畜禽遺傳變異，基因編輯的主要目的是對目標變異位點進行精確的點突變修復(fù)，而非對基因進行隨機破壞。因此，研究人員試圖提高HDR 的效率并抑制NHEJ 以提高基因編輯的準確性［13-15］，同時不斷研究開發(fā)可進行精確堿基修飾的基因編輯新技術(shù)。

1.2 單堿基編輯技術(shù)的發(fā)展

1.2.1胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)（Cytosine Base Editor,CBE）2016 年，哈佛大學的Liu 研究團隊報道了一種基于 CRISPR 系統(tǒng)的單堿基編輯器（Base Editor,BE），是一種不需要引入 DNA 雙鏈斷裂即可進行單堿基轉(zhuǎn)換的基因編輯系統(tǒng)CBE。CBE系統(tǒng)可在基因組靶位點上實現(xiàn)C →T 堿基的替換［15］。構(gòu)建CBE 首先要對Cas9 蛋白進行改造，通過點突變使其切割結(jié)構(gòu)域失去活性而獲得dead Cas9（dCas9），接著通過連接肽鏈將dCas9 蛋白與胞嘧啶脫氨酶連接形成CBE（圖2）。CBE 系統(tǒng)通過sgRNA 的引導(dǎo)將dCas9 錨定到基因組靶位點上，dCas9 與 DNA 雙鏈結(jié)合但不發(fā)生切割，此時胞嘧啶脫氨酶使靶位點上的堿基C 脫去氨基變?yōu)閁，當 DNA 發(fā)生復(fù)制時，U 會被替換為T，而DNA 互補鏈上的G 相應(yīng)地被替換成A，從而實現(xiàn)G-C 堿基對到A-T 堿基對的替換（圖2）。通過DNA 的復(fù)制和修復(fù)，實現(xiàn)了不需要引入DNA 雙鏈斷裂即可進行單堿基轉(zhuǎn)換的編輯。

圖2 胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)［15］Fig.2 Cytosine base editor system［15］

1.2.2腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（Adenine Base Editor,ABE）2017 年，Liu 研究團隊在開發(fā)CBE 系統(tǒng)的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，進一步開發(fā)出腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)ABE。他們發(fā)現(xiàn)目前已知的腺嘌呤脫氨酶均不能以DNA 為底物對堿基A 進行脫氨，因此，他們以大腸桿菌tRNA 脫氨酶（TadA）為基礎(chǔ)，通過定向進化篩選到能作用于單鏈DNA 的腺嘌呤脫氨酶突變體，該突變體含有A106V 和D108N 兩 個突變，被 命名為TadA*［16］。通 過XTEN 連接肽將nCas9（D10A）切刻酶與TadA*進行連接，并在nCas9 的C 端加上核定位信號（Nuclear Localization Signal,NLS），形成TadA*-XTEN-nCas9-NLS，最終獲得了能實現(xiàn)A-T 堿基對到G-C 堿基對轉(zhuǎn)換的ABE 編輯器［16］。ABE系統(tǒng)在工作過程中，將堿基A 脫去氨基，變成I，DNA 聚合酶將I 識別為G，使其與C 配對，經(jīng)過下一輪DNA 復(fù)制即可實現(xiàn)A-T 堿基對到G-C 堿基對的轉(zhuǎn)換（圖3）。

圖3 腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)［16］Fig.3 Adenine base editor system［16］

單堿基編輯技術(shù)是在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基礎(chǔ)上發(fā)展建立起來的，相比于 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 HDR 編輯，單堿基編輯既不會誘導(dǎo)基因組發(fā)生DSB，也不需要額外添加DNA 重組修復(fù)模板，有效降低了脫靶所造成的基因組Indel 發(fā)生。在動物育種研究中，單堿基編輯技術(shù)已展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景［17-19］，但是該技術(shù)目前還存在一些不足，其中一個突出問題是編輯結(jié)果帶有副產(chǎn)物，以及編輯窗口寬度受限，導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受到一定限制［20］。

1.2.3先導(dǎo)編輯系統(tǒng)（Prime Editor,PE）CBE和ABE 組合雖然可以進行4 種堿基轉(zhuǎn)換（C →T,G →A,A →G,T →C），但無法對另外8 種堿基轉(zhuǎn)換（C →A,C →G,G →C,G →T,A →C,A →T,T →A,T →G）以 及Indel 起作用。而2019 年問世的先導(dǎo)編輯技術(shù)PE 則可以在不依賴DSB 和模板DNA 的條件下有效實現(xiàn)12 種堿基轉(zhuǎn)換，此外還能有效實現(xiàn)多堿基的插入（最多可插入44 bp）和刪除（最多刪除80 bp）［21］。PE系統(tǒng)利用先導(dǎo)編輯向?qū)NA（prime editing guide RNA,pegRNA）引導(dǎo)Cas9 切刻酶（nCas9）與逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白在基因組靶位點實現(xiàn)基因編輯［21］。其中，peg RNA 由3 部分組成，包括單鏈向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）、引物結(jié)合位點（Prime Binding Site,PBS）和攜帶有靶位點編輯信息的逆轉(zhuǎn)錄模板（RT template including edit）。pegRNA 依靠其sgRNA 序列引導(dǎo)nCas9 蛋白結(jié)合到基因組靶位點上，并切斷含有PAM 序列的DNA 單鏈。斷裂的DNA 單鏈與 pegRNA 上的 PBS 序列互補結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶則以RT 序列作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)完成后，DNA 切口處出現(xiàn)3' flap（分支結(jié)構(gòu)）和5' flap 的動態(tài)平衡。其中3' flap 含有目標突變，而5' flap 不含目標突變但更易被結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶FEN1（片狀核酸內(nèi)切酶）切除，殘余的5' flap 堿基將進一步被5'核酸外切酶EXO1 切除，最后經(jīng)過DNA 鏈的連接和修復(fù)實現(xiàn)目標序列的替換（圖4）。

圖4 先導(dǎo)編輯系統(tǒng)［21］Fig.4 Prime editor system［21］

2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用

自2013 年張鋒研究團隊在真核細胞中成功進行基因編輯以來［10］，CRISPR/Cas9 技術(shù)發(fā)展迅速，在動物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9 技術(shù)突破了傳統(tǒng)育種的局限性，可在較短時間內(nèi)培育出傳統(tǒng)育種方法無法育成或難以育成的動物品種，從而加快動物遺傳改良進展。目前CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在家豬遺傳育種研究中的關(guān)鍵進展如下 。

2.1 在高繁殖力育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

豬的繁殖 性能水平直接決定了整個繁育體系的效率，是生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。母豬繁殖力屬于低遺傳力性狀，通過常規(guī)育種技術(shù)獲得遺傳進展緩慢。因此，通過對調(diào)控繁殖性能的關(guān)鍵候選基因進行編輯，有望加快培育出高繁殖力豬品種。目前已鑒定到BMP15基因是調(diào)控單胎動物排卵率和產(chǎn)仔數(shù)的1 個關(guān)鍵基因［22-30］，但它對多胎家豬繁殖力的調(diào)控功能尚不明確［31-32］。Shi等［33］應(yīng)用CRISPR/Cas9 編輯BMP15外顯子1 區(qū)域，獲得一批基因編輯大白豬，但雙等位基因編輯的母豬均不育；通過對卵巢進行HE 組織切片分析發(fā)現(xiàn)，雙等位基因編輯豬卵泡中的細胞核著色較深，而且有顆粒細胞丟失和卵母細胞形態(tài)異常等現(xiàn)象，在次級卵泡階段卵泡發(fā)育阻滯，導(dǎo)致無法產(chǎn)生可排卵的成熟卵泡。但編碼BMP15 蛋白前導(dǎo)肽序列產(chǎn)生66 bp 缺失的基因編輯雜合子母豬，其初產(chǎn)活仔13 頭，明顯高于供體細胞來源的英系大白母豬的繁殖性能（初產(chǎn)母豬窩均產(chǎn)活仔數(shù)為8.46±2.83；經(jīng)產(chǎn)母豬窩均產(chǎn)活仔數(shù)為9.15±2.84）［34］，表現(xiàn)出高產(chǎn)潛能，揭示BMP15基因?qū)邑i繁殖性能具有重要調(diào)控作用，通過精確編輯該基因有望培育出高繁殖力豬品種。

2.2 在高產(chǎn)肉性能育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

肌生成抑制素（Myostatin,MSTN）是肌肉生長的負調(diào)控因子，通過抑制成肌細胞的增殖發(fā)揮作用［35］Li 等［36］在兩廣小花豬的MSTN信號肽區(qū)域引入突變（PVD20H 和GP19del），結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變可引起MSTN基因表達下調(diào)，使肌纖維數(shù)量增加，促進地方豬的肌肉生成，表明MSTN基因信號肽區(qū)域的精確編輯可以促進豬的肌肉發(fā)育。Zhu 等［37］通過敲除MSTN基因促進了中國巴馬豬的生長，并增加豬的瘦肉產(chǎn)量，其中6 月齡時MSTN基因編輯豬比野生型重約9.6%。Li等［38］研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除雜合子梅山豬的骨骼肌重量增加9%，脂肪含量降低8.48%。胰島素樣生長因子2（IGF2）對動物胎兒發(fā)育以及出生后的生長發(fā)育均發(fā)揮重要作用。研究表明，豬IGF2基因內(nèi)含子3 的3072 位點若發(fā)生單堿基突變（G →A），會引起IGF2基因的抑制因子ZBED6 從結(jié)合基序（motif）上解離，進而提高IGF2基因的表達水平，使豬的瘦肉量增加3%～4%［39］。Liu 等［40］對兩廣小花豬的胚胎成纖維細胞IGF2內(nèi)含子3 中的ZBED6 結(jié)合基序進行破壞，結(jié)果可顯著上調(diào)IGF2的表達，增強了豬胚胎成纖維細胞（Porcine Embryonic Fibroblast,PEFs）的成肌分化潛能和細胞增殖能力；他們以IGF2基因編輯細胞作為供體，通過體細胞克隆獲得ZBED6 結(jié)合基序缺失63 bp 的兩廣小花豬純合個體，該基因編輯豬肌肉發(fā)育顯著增強，在338 d 時體重比野生型豬提高32%。Xiang 等［41］對IGF2 基因內(nèi)含子3 的3072 位點進行編輯，發(fā)現(xiàn)這些突變解除了ZBED6 與其基序的結(jié)合作用，顯著提高了巴馬豬的生長性能，胴體重比野生型提 高33.35%。Wang 等［42］敲 除ZBED6 獲得了ZBED 6-/-瘦肉型巴馬豬，其IGF2 表達量顯著上調(diào)，骨骼肌和內(nèi)臟器官的重量顯著高于野生型，進一步證明了IGF2-ZBED6 在器官生長發(fā)育中的重要調(diào)控作用。

2.3 在抗病育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

疫病防控是保障生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，通過基因編輯提高家豬的抗病能力可有效提升豬場的經(jīng)濟效益。豬繁殖與呼吸綜合征是當前豬場疾病防控最備受關(guān)注的疾病之一，該病是由豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種高危傳染病，俗稱藍耳病。PRRSV通過感染家豬的巨噬細胞或單核細胞，進一步引發(fā)懷孕母豬在妊娠后期流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失［43］。2016 年Whitworth 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)培育了CD163基因編輯豬。通過攻毒實驗發(fā)現(xiàn)，CD163基因缺失的豬可完全抵抗PRRSV 感染，表明CD163 是PRRSV感染所必需的受體［44］。2017 年該研究團隊將CD163 蛋白的清道夫受體半胱氨酸5（Scavenger Receptor Cysteine Rich 5,SRCR5）結(jié)構(gòu)域替換為人類CD163-like SRCR8 結(jié)構(gòu)域，培育出I 型PRRSV 抗性豬［45］。刪除CD163 SRCR5 結(jié)構(gòu)域中含有配體結(jié)合口袋（Ligand-binding pocket,LBP）的41aa 片段，獲得基因編輯大白豬，經(jīng)攻毒試驗證明該基因編輯豬對Ⅱ型PRRSV 具有完全抗性［46］。這些研究表明，通過編輯CD163基因可以產(chǎn)生PRRSV 抗性豬品種，可有效消除PRRSV對生豬生產(chǎn)的威脅。除PRRSV 外，傳染性胃腸炎病毒（TGEV）也是一種具有高度接觸傳染性的病毒性疾病，常與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬輪狀病毒（PoRV）等豬腹瀉相關(guān)病毒同時感染［47］。TGEV 是一種單鏈陽性RNA 冠狀病毒，以豬腸道上皮細胞為感染靶點。目前認為pAPN蛋白是介導(dǎo)TGEV 感染的關(guān)鍵受體。TGEV 的糖蛋白與小腸上皮細胞表面的pAPN 受體結(jié)合后可介導(dǎo)膜融合，從而導(dǎo)致病毒進入到上皮細胞內(nèi)［48］。Whitworth 等［49］報道，APN 敲除豬斷奶后對TGEV 有抗性，但對PEDV 無抗性。Xu 等［50］利用基因編輯技術(shù)同時敲除CD163和pAPN，發(fā)現(xiàn)雙基因敲除豬（Double-gene-Knockout,DKO）可以同時抵抗PRRSV 和TGEV 感染；此外，除肉色評分和鐵含量外，DKO 豬和野生型WT 豬的生產(chǎn)性能、繁殖性能和豬肉營養(yǎng)成分含量均無顯著性差異。

2.4 在性別控制上的應(yīng)用

仔豬閹割是生豬生產(chǎn)中的一個重要環(huán)節(jié)，可以減少雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的能量消耗，以最大化發(fā)揮豬的生長效能，還可消除公豬性激素產(chǎn)生的騷味導(dǎo)致的豬肉口感與品質(zhì)下降。但是仔豬閹割是一項耗費精力和成本的工作，而且對仔豬會產(chǎn)生很大的刺激，如果操作不當容易引起感染，甚至會影響后期生長。此外，閹割還涉及動物倫理與福利問題，因此，如能通過基因編輯技術(shù)使母豬所產(chǎn)仔豬均為雌性個體，將有效避免仔豬閹割帶來的問題。

性別控制技術(shù)是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預(yù)，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望的單一性別后代的一門生物技術(shù)。哺乳動物Y 染色體上存在一個性別決定區(qū)域，即SRY基因，SRY基因又稱為睪丸決定因子（Testis Determining Factor,TDF），是哺乳動物性別決定的總開關(guān)［51-52］。研究發(fā)現(xiàn)，SRY基因的突變與人類及其他哺乳動物的性逆轉(zhuǎn)綜合征相關(guān)［51］。Kurtz［53］等使用CRISPR/Cas9 技術(shù)對豬SRY的HMG 結(jié)構(gòu)域進行編輯，發(fā)現(xiàn)SRY基因編輯雄性仔豬發(fā)育出完整的雌性生殖器官，其子宮和輸卵管形態(tài)與野生型母豬的相同，但卵巢相對較小，證明位于SRY基因的HMG 結(jié)構(gòu)是豬SRY 蛋白的主要功能區(qū)域，具有決定性別發(fā)育的關(guān)鍵作用。

2.5 在多性狀遺傳改良中的應(yīng)用

在家豬基因組上同時實現(xiàn)多位點單堿基編輯，可同時對家豬的多個性狀進行改良。Song等［54］以PRRSV 抗性基因CD163和控制生長性能的主效基因MSTN和IGF2為靶點，在豬受精卵中注射CBE 系統(tǒng)，有效實現(xiàn)了多個位點上C →T 的替換。他們發(fā)現(xiàn)在CD163和MSTN基因中突變均形成了1 個終止密碼子，破壞了2 個基因的表達；同時在IGF2中引入1 個有益的等位基因，可增強IGF2的表達。生長性能分析結(jié)果表明，編輯豬的生長速度顯著快于野生型豬，且組織切片分析表明，編輯豬肌纖維的平均橫截面積較野生型豬增大約160%,而纖維數(shù)量則降低23%。為了評估豬對病毒感染的抵抗力，使用PRRSV 毒株CH-1R 進行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編輯豬的PRRSV 抗體在所有時間點均為陰性，而野生型豬則在感染7～10 d 一直呈陽性。該研究結(jié)果表明多位點單堿基編輯可同時提高豬的生長性能和抗病性［54］（表1）。

表1 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用Table 1 Application of CRISPR/Cas gene editing technology in genetic improvement of pigs

3 展望

目前CRISPR/Cas9 以及單堿基編輯在家豬遺傳育種上的應(yīng)用主要側(cè)重于編輯具有較大遺傳效應(yīng)的單個基因或位點，有效突破了傳統(tǒng)育種的局限性。但目前鑒定到的影響家豬繁殖力、生長、產(chǎn)肉量、肉質(zhì)和抗病性的關(guān)鍵基因和位點寥寥無幾，而且這些性狀還受大量微效基因控制。未來隨著對包括家豬在內(nèi)的動物基因組與表型組之間關(guān)系了解程度的進一步加深，多基因編輯將有可能成為改良家豬單個或多個重要經(jīng)濟性狀的重要手段。目前CRISPR/Cas9 技術(shù)雖然可以實現(xiàn)有限的多基因編輯，但對于同時編輯數(shù)十個甚至上百個基因或位點卻無法實現(xiàn)，因此，未來需要改進基因編輯工具或在編輯策略上進行探索，創(chuàng)建一套穩(wěn)定可靠的多基因編輯技術(shù)，以有效提高點突變效率，這樣才有可能對控制家豬重要經(jīng)濟性狀的多個微效基因或位點進行同時編輯，獲得預(yù)期目標的遺傳改良效果。

基因編輯動物能否順利進入商業(yè)化應(yīng)用，不僅受到政府主管部門監(jiān)管理念與具體管理措施的影響，同時還受到公眾對基因編輯技術(shù)認知和接受程度的影響。目前雖然全球多數(shù)國家對基因編輯動物的監(jiān)管標準尚未明確，但學界一致認為基因編輯動物只要通過嚴格的生物安全評價，可有序進入商業(yè)化應(yīng)用。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對基因編輯動物監(jiān)管嚴格，認為對待基因編輯動物應(yīng)如同對待新藥一樣，須進行一系列的生物安全檢測。2020 年12 月由美國Revivicor公司研發(fā)的基因編輯豬“GalSafe 豬”，經(jīng)過一系列嚴格的生物安全評價后獲得FDA 批準上市。“GalSafe 豬”經(jīng)CRISPR/Cas9 敲除了α-半乳糖苷寡糖的表達基因，使得對肉類過敏的人群也可以安全食用這種豬肉，為基因編輯豬的商業(yè)化應(yīng)用開創(chuàng)了先例。2022 年1 月我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，打開了基因編輯植物商品化的大門，也為基因編輯農(nóng)業(yè)動物的商業(yè)化應(yīng)用指引了方向。