投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和肝臟生長相關(guān)基因表達(dá)量的影響

黃文慶，黃 龍，賴明建，李湘妮，陳佳佳，劉鳳坤，徐志雄，胡俊茹

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室/廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 5106 40；2.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣東 廣州 510640；3.佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 佛山 528145；4.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院/廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點實驗室，廣西 欽州 535011）

【研究意義】大口黑鱸又稱加州鱸，隸屬于鱸形目（Perciformes）鱸亞目（Porcoidei）太陽魚科（Cehtrachidae）黑鱸屬（Micropterus），原產(chǎn)于美國加利福尼亞州密西西 比河流域［1］，具有廣溫性、耐低氧［2］、長速快、易捕獲、無肌間刺等生物學(xué)特性。大口黑鱸已成為我國大宗特種淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，因其肉質(zhì)鮮美和營養(yǎng)價值高等 優(yōu)點［3］而廣受消費者喜愛，在國內(nèi)具有廣闊的消費市場。近幾年大口黑鱸養(yǎng)殖規(guī)模和年產(chǎn)量快速擴(kuò)增，我國大口黑鱸養(yǎng)殖區(qū)域主要集中分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建等地［3］。據(jù)統(tǒng)計，2021 年全國大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)50 萬t 以上，其中廣東占比近60%。隨著大口黑鱸營養(yǎng)需求與飼料配方技術(shù)研究的不斷深入，通過開發(fā)優(yōu)質(zhì)實用型全價配合飼料，推廣科學(xué)的食性馴化和飼料投喂技術(shù)，有望替代投喂冰鮮雜魚的養(yǎng)殖模式。

【前人研究進(jìn)展】人工養(yǎng)殖條件下魚類的生長受環(huán)境因素和養(yǎng)殖管理因素的雙重作用。水溫是影響魚類攝食、生長、繁殖、新陳代謝及滲透壓調(diào)節(jié)等機體活動的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。不同品種的魚類適宜在不同水溫條件下生長。草魚的最適生長水溫為28～32 ℃［4］，鯉魚更適宜在20 ℃水溫條件下生長［5］。陳思等［6］比較分析了17～37 ℃水溫條件下龍虎斑幼魚的生長情況，認(rèn)為33 ℃水溫條件下龍虎斑幼魚生長最快。大口黑鱸的最適生長水溫在20～30 ℃［7］。而養(yǎng)殖密度、投喂頻率通常被認(rèn)為是集約化人工養(yǎng)殖模式下影響魚類產(chǎn)量的重要管理因素［8-9］。謝蘇明等［10］研究認(rèn)為，大口黑鱸在工程化循環(huán)水養(yǎng)殖條件下的適宜投喂頻率為2 次/d。倪金金等［11］研究發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸放養(yǎng)密度以0.2～0.4 kg/m3為宜，有利于促進(jìn)魚的生長和提高肝臟生長基因的表達(dá)量。王裕玉等［12］認(rèn)為，在養(yǎng)殖前期的幼魚階段采取高密度養(yǎng)殖方式不影響大口黑鱸的生長，養(yǎng)成至大規(guī)格魚種階段再降低密度可減少應(yīng)激引起的生長變緩。

【本研究切入點】大口黑鱸在養(yǎng)殖過程中，往往受到投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度的交互影響，目前有關(guān)三因素對大口黑鱸交互作用的研究未見報道。在一定水溫范圍內(nèi)，養(yǎng)殖過程中投喂頻率和養(yǎng)殖密度與水溫往往呈正相關(guān)；但在過高的水溫范圍，投喂頻率和養(yǎng)殖密度與水溫呈負(fù)相關(guān)，而投喂頻率與養(yǎng)殖密度呈正相關(guān)，尤其是在魚苗的標(biāo)粗階段。研究發(fā)現(xiàn)，魚類生長主要取決于攝食率和飼料轉(zhuǎn)化率［13］，在適宜的水溫范圍內(nèi)，魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收與水溫呈正相關(guān)［14］，而適當(dāng)提高養(yǎng)殖密度和投喂頻率，可提高魚類的生長速度和單位養(yǎng)殖產(chǎn)量［11,15］。本試驗研究不同水平的投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸的交互影響，除比較生長性能指標(biāo)的差異外，還基于腸道組織發(fā)育和肝臟生長相關(guān)基因表達(dá)量作進(jìn)一步探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究不同投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸生長性能、腸道組織結(jié)構(gòu)和肝臟生長激素（GH）、類胰島素樣生長因子-1（IGF-1）基因表達(dá)量的影響，從而確定適宜的投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度，為大口黑鱸高效養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大口黑鱸魚苗購自陽山利陽水產(chǎn)科技有限公司。魚苗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所水泥池中暫養(yǎng)馴化2 周，每天早、晚投喂2 次，待魚苗健康穩(wěn)定且攝食正常后，挑選規(guī)格均勻、體格健康、平均體質(zhì)量為17 g 左右的魚苗作為試驗對象。試驗期間各處理均投喂相同的大口黑鱸商品配合飼料（購自佛山順德區(qū)豐華飼料實業(yè)有限公司），飼料含粗蛋白質(zhì)50.68%、粗脂肪10.15%、水分8.46%、粗灰分12.57%、鈣44.81%和總磷2.82%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用3 因素（投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度）2 水平（2×2×2）交互設(shè)計8 個處理（表1），各處理4 個重復(fù)。投喂頻率，設(shè) 2 次/d（8:00、20:00）、3 次/d（8:00、14:30 和20:00）；水溫，設(shè)25、30 ℃；養(yǎng)殖密度，設(shè)25、35 尾/缸（150 升）。投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度的水平設(shè)置參考人工養(yǎng)殖常見管理模式和水質(zhì)條件。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

養(yǎng)殖試驗于2021 年6 月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所室內(nèi)溫控循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展，系統(tǒng)缸水體為150 L，每4 個缸體配備一套獨立循環(huán)過濾裝置。采用飽食方式投喂，并根據(jù)各處理攝食情況調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖試驗期間為自然光照，水溫根據(jù)各處理目標(biāo)值設(shè)定，氨氮濃度＜0.02 mg/L，亞硝酸鹽濃度＜0.05 mg/L，溶氧濃度＞5.0 mg/L，pH 7.8～8.2。養(yǎng)殖試驗為期8 周。

1.3 樣品采集和檢測分析

養(yǎng)殖試驗結(jié)束前禁食24 h，稱量每缸大口黑鱸的總質(zhì)量，并統(tǒng)計每缸的存活尾數(shù)，計算生長性能指標(biāo)。從每缸中選取接近均重的6 尾魚，測量體長，稱量體質(zhì)量、腹脂質(zhì)量，計算形體指標(biāo)。計算公式如下：

特定生長率（SGR,%/d）=100×（ln 終末均重-ln 初始均重）/試驗天數(shù)；

攝食率（FR，g/尾）=攝食總量/（初始尾數(shù)+末尾數(shù)）/2；

成活率（SR，%）=100×終末魚的尾數(shù)/初始魚的尾數(shù)；

飼料系數(shù)（FCR）=攝食量/（終末總質(zhì)量+死亡總質(zhì)量-初始總質(zhì)量）；

肥滿度（CF，%）=100×體質(zhì)量/體長3；

腹脂率（AFY，%）=100×腹脂質(zhì)量/體質(zhì)量。

采集3 尾魚的前腸樣品，置于福爾馬林固定液中保存，用于腸道組織結(jié)構(gòu)測定；采集肝臟樣品，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于GH和IGF-1基因表達(dá)量測定。

腸道組織切片：通過脫水、包埋、切片、染色、封片后使用PANNORAMIC 全景切片掃描儀進(jìn)行觀察，通過Image-Pro Plus 6.0 分析軟件測定絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

肝臟GH和IGF-1基因的相對表達(dá)量測定：根據(jù)TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒方法提取肝臟總RNA，通過電泳檢測總RNA 的完整性。采用TaKaRa PrimeSciptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（-20 ℃保存待用）。應(yīng)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計引物，根據(jù)NCBI 獲得的大口黑鱸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其相關(guān)基因的全長序列設(shè)計特異性引物，所有引物（表2）均由廣州興譽生物科技有限公司合成。

表2 實時定量 PCR 引物Table 2 Real-time quantitative PCR primers

GH、IGF-1、18S和β-actin基因的表達(dá)量采用 TaKaRa TB GreenTMFast qPCR Mixc 進(jìn) 行RTPCR 反應(yīng)，然后采用 SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進(jìn)行實時定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、58 ℃復(fù)性10 s，進(jìn)行40 個循環(huán)；熔解反應(yīng)條件為65～95 ℃。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) RT-PCR 的擴(kuò)增曲線和熔解曲線。以β-actin和18S為內(nèi)參，對得到的各樣品Ct值進(jìn)行均一化處理，以投喂頻率2 次/d 處理的各基因mRNA 水平為基準(zhǔn)，應(yīng)用2-ΔΔCt法確定不同頻率處理大口黑鱸的mRNA 相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS22.0 軟件對所有組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 氏多重比較，用一般線性模型單變量方法分析投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度的主效應(yīng)以及交互效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸生長性能的影響

單因素方差分析結(jié)果（表3）顯示，處理Ⅴ的大口黑鱸特定生長率比處理Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ，分別顯著提高10.16%、10.61%、9.27%和8.40%；攝食率比處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ分別顯著提高10.94%、27.02%、26.45%和17.38%，飼料系數(shù)比處理Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ，分別顯著降低7.87%、8.89%和8.89%，肥滿度高于其他各處理，且與處理Ⅲ、Ⅶ差異顯著，腹脂率與其他處理相比差異不顯著，存活率各處理間均無顯著差異。主效應(yīng)分析結(jié)果（表3）顯示，僅養(yǎng)殖密度對攝食率的影響和投喂頻率對肥滿度的影響達(dá)顯著水平。交互效應(yīng)對肥滿度影響達(dá)顯著水平，對特定生長率、攝食率、飼料系數(shù)、存活率和腹脂率影響均未達(dá)顯著水平。

表3 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸生長性能的影響Table 3 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on growth performance of largemouth bass

2.2 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

單因素方差分析結(jié)果（表4）顯示，處理Ⅴ的大口黑鱸腸道絨毛高度比處理Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ，分別顯著提高27.12%、19.05%和27.12%。處理Ⅰ絨毛寬度比處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ分別顯著提高25.00%、36.36%、25.00%、25.00%、15.38%和25.00%；處理Ⅴ絨毛寬度比處理Ⅲ顯著提高27.27%。處理Ⅰ、Ⅲ肌層厚度比處理Ⅶ分別顯著提高46.15%和30.77%，其他各處理間均無顯著差異。主效應(yīng)和交互效應(yīng)對腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的影響均未達(dá)顯著水平（表4）。

表4 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on intestinal tissue structure of largemouth bass

2.3 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-1 基因表達(dá)量的影響

單因素方差分析結(jié)果（表5）顯示，大口黑鱸肝臟的GH和IGF-1基因表達(dá)量存在顯著差異，但處理Ⅳ、Ⅷ以及處理Ⅲ、Ⅵ的GH 基因表達(dá)量組間差異不顯著，處理Ⅲ、Ⅵ以及處理Ⅳ、Ⅶ的IGF-1基因表達(dá)量差異不顯著，GH基因表達(dá)量大小依次為處理Ⅰ＞Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅷ，IGF-1基因表達(dá)量大小依次為處理Ⅴ＞Ⅰ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅱ。主效應(yīng)和交互效應(yīng)對肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量影響均未達(dá)顯著水平（表5）。

表5 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-1 基因表達(dá)量的影響Table 5 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on hepatic GH and IGF-1 gene expression levels of largemouth bass

3 討論

3.1 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸生長性能的影響

養(yǎng)殖過程中魚類攝食往往受到水溫、養(yǎng)殖投喂頻率和養(yǎng)殖密度等外部條件的影響。有研究報道投喂頻率影響魚類的攝食率和飼料轉(zhuǎn)化率［16］，魚類的攝食率與投喂頻率在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，對代謝速度快的肉食性魚類可適當(dāng)提高投喂頻率，提高魚類的攝食率和飼料轉(zhuǎn)化率，增加營養(yǎng)物質(zhì)的攝入，從而促進(jìn)魚類生長［17］。但過高的投喂頻率，易造成營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收不完全排出體外，且頻繁的攝食活動會增加魚體的能量消耗，反而不利于魚類生長［18］。研究發(fā)現(xiàn)，在飽食投喂的實驗條件下，增加投喂頻率可提高軍曹魚［17］和黃蓋鰈［19］的采食量和生長速率，但謝蘇明［18］研究發(fā)現(xiàn)，60 d 的養(yǎng)殖周期以2～4 次/d 的頻率投喂，大口黑鱸的末均重、增重率和特定生長率無顯著差異，2 次/d 的投喂頻率足以滿足大口黑鱸生長發(fā)育的營養(yǎng)需求。檀晨曦［20］研究認(rèn)為，養(yǎng)殖花鰻鱺的最優(yōu)投喂頻率為2 次/d。

魚類屬于變溫動物，水溫是其生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一［21］。據(jù)報道大口黑鱸屬于溫水性魚類，其最適水溫為15～30 ℃，最佳生長水溫為20～25 ℃［22］。楊斯琪等［23］研究發(fā)現(xiàn)，幼魚階段的大口黑鱸的最適生長水溫為21～25 ℃，與本研究結(jié)果基本一致。養(yǎng)殖密度是決定魚類生長速度和單位產(chǎn)量的主要因素之一［24］，適當(dāng)提高單位養(yǎng)殖密度，可提高單位產(chǎn)量和養(yǎng)殖效益。但過度的高密度養(yǎng)殖對魚類形成擁擠脅迫，反而對魚類的生長起抑制作用［20］。本試驗結(jié)果表明，主效應(yīng)僅投喂頻率對肥滿度和養(yǎng)殖密度對攝食率的影響達(dá)顯著水平，投喂頻率、養(yǎng)殖密度對其他生長性能和形體指標(biāo)的影響未達(dá)顯著水平，而水溫對生長性能特定生長率、攝食率、飼料系數(shù)、存活率以及形體指標(biāo)的肥滿度和腹脂率均無顯著影響；交互效應(yīng)均僅對肥滿度有顯著影響，對特定生長率、攝食率、飼料系數(shù)、存活率和腹脂率均無顯著影響。單因素方差分析結(jié)果顯示，處理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）大口黑鱸的特定生長率、攝食率、飼料系數(shù)顯著優(yōu)其他各處理，其次為處理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸），處理Ⅴ與處理Ⅰ相比，生長性能各指標(biāo)無顯著差異，說明本試驗條件下，大口黑鱸幼魚最適宜投喂頻率為2～3 次/d，水溫為25 ℃，養(yǎng)殖密度為25 尾/缸，這一結(jié)果與謝蘇明［18］和楊斯琪等［23］的報道結(jié)果基本一致。

3.2 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響投喂頻率

腸道是魚類運輸食物和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所［25］。在魚類營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域，一般通過研究腸道組織結(jié)構(gòu)來評估魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，從而間接反映魚類的生長情況。腸道絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度是反映腸道組織結(jié)構(gòu)的3 個重要指標(biāo)，其中絨毛長度和絨毛寬度可反映腸道組織消化吸收的表面積大小，而肌層厚度可反映腸道的收縮能力，可間接反映機體腸道組織的消化吸收能力。本試驗?zāi)c道組織切片結(jié)果顯示，投喂頻率、水溫、養(yǎng)殖密度及三因素交互作用對腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均無顯著影響。謝蘇明［18］研究發(fā)現(xiàn)，投喂頻率對大口黑鱸腸道絨毛高度和絨毛寬度無顯著影響，但2 次/d 投喂頻率處理的大口黑鱸腸道肌層厚度顯著厚于4 次/d 的投喂處理。本試驗處理Ⅰ、Ⅴ大口黑鱸的腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度整體大于其他處理，與個別處理差異達(dá)顯著水平，這一結(jié)果與本試驗大口黑鱸的生長性能特定生長率和攝食率結(jié)果呈正相關(guān)。

3.3 投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-I 基因表達(dá)量的影響

魚類的營養(yǎng)代謝和生長發(fā)育受到GH、IGF-1相關(guān)基因調(diào)控。魚類的GH 主要由魚腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)GH 在羅非魚肝臟中也有表達(dá)，但在肝臟中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于腦垂體［26］。GH 作為魚類生長發(fā)育過程中的調(diào)控因子，發(fā)揮了促進(jìn)生長、調(diào)控攝食、促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪代謝、調(diào)節(jié)魚類滲透壓和提高飼料轉(zhuǎn)化率的生理作用。魚類IGF-1 主要由GH 與靶細(xì)胞膜表面的GHR結(jié)合后，開啟細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制，促成魚類肝臟組織細(xì)胞合成和分泌一類多肽類激素［11,27］，IGF-1 在魚類生長發(fā)育過程中發(fā)揮的主要作用是作為GH的介導(dǎo)激素，介導(dǎo)GH 促進(jìn)動物機體生長的因子［28］。本研究單因素方差分析結(jié)果顯示，各試驗處理肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量均有顯著差異，但無明顯的規(guī)律趨勢；肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量各處理比較，處理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸）和處理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）整體高于其他處理，表明大口黑鱸幼魚在投喂頻率為2～3 次/d、水溫為25 ℃、養(yǎng)殖密度為25 尾/缸的養(yǎng)殖條件下，肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量高于其他條件。這一結(jié)果與本試驗特定生長率結(jié)果一致，表明肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量可作為評估指標(biāo)來反映魚類的生長情況，這與謝蘇明等［10］報道的觀點相一致。以往關(guān)于投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度三因素交互對魚類影響的研究未見報道，本試驗主效應(yīng)分析結(jié)果表明，投喂頻率、水溫、養(yǎng)殖密度及三者交互效應(yīng)對肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量均無顯著影響。但肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量與投喂頻率、水溫和養(yǎng)殖密度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。謝蘇明等［10］研究發(fā)現(xiàn)以2 次/d頻率投喂的大口黑鱸幼魚肝臟GH（P＞0.05）和IGF-1（P＜0.05）的基因表達(dá)量高于以3 次/d 頻率投喂的處理。王曉梅等［29］研究發(fā)現(xiàn)，胡子鯰低密度處理GH基因表達(dá)量高于高密度處理。

4 結(jié)論

本試驗條件下，主效應(yīng)投喂頻率僅對形體指標(biāo)肥滿度有顯著影響，養(yǎng)殖密度僅對采食率有顯著影響，水溫對生長性能、腸道組織結(jié)構(gòu)、肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量各指標(biāo)均無顯著影響，3 因素交互效應(yīng)僅對肥滿度有顯著影響，對其他各指標(biāo)均無顯著影響。經(jīng)單因素方差分析和Duncan 氏多重比較，大口黑鱸生長性能、腸道組織結(jié)構(gòu)及肝臟GH和IGF-1基因表達(dá)量結(jié)果表明，本試驗條件下大口黑鱸最適宜的投喂頻率為2～3 次/d，水溫為25 ℃，150 L 水體養(yǎng)殖25 尾。