廣東花生果腐病病原菌鑒定及藥劑篩選試驗

邢玨珺，許毓釗，蘇鈺彤，魏欣瑩，江海琪，喻國輝，尹 艷

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院實驗與設(shè)備處，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院植物健康創(chuàng)新研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣東省普通高校果蔬病蟲害綠色防控重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)業(yè)與生物學院，廣東 廣州 510225；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院資源與環(huán)境學院，廣東 廣州 510225；5.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】花生果腐病是世界性分布的花生重大土傳病害，主要由鐮刀菌（Fusariumspp.）和腐霉菌（Pythiumspp.）等病原真菌復(fù)合感染引起，在我國花生產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生并造成嚴重的經(jīng)濟損失，是影響花生產(chǎn)量的重要因素之一［1-2］?！厩叭搜芯窟M展】花生果腐病最早在美國報道，患病花生地上部分無癥狀，病害主要為害果柄和莢果，不同發(fā)育階段的莢果均可受害，果仁也表現(xiàn)出不同程度的腐爛［3］，由群結(jié)腐霉P.myriotylum和茄病鐮刀菌F.solani混合感染引起［4］。國內(nèi)花生果腐病最早在河北省被發(fā)現(xiàn)，鑒定的病原菌也是P.myriotylum和F.solani［5］。從地理分布上來看，鐮刀菌引起的花生果腐病在我國發(fā)生最為普遍，包括河北［1］、山東［6］和海南［7］。除此之外，近年來還有一些新的病原菌報道，如P.deliense［8］、Neocosmospora vasinfecta［9］和N.striata［10］都可以引起花生果腐病。對花生果腐病的防控主要從抗性品種選育［11-13］、土壤調(diào)理劑應(yīng)用［14］和生物防治［15-16］等幾個方面展開：山東花生研究所測試了76 個花生品種（系）對花生果腐病的抗性，未發(fā)現(xiàn)免疫品種，但獲得高抗品種2 個、抗病品種7 個、中抗品種12個，其中花育9115 的抗性最好［13］；在吉林利用解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWM-1 的可濕性粉劑和固體發(fā)酵劑對花生果腐病開展的田間防控效果顯示，固體發(fā)酵劑具有明顯的防效和增產(chǎn)效果［17］；利用解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）GF-3 和GF-22 制備的生物有機肥也能夠顯著降低由花生侵脈新赤殼菌（N.vasinfecta）引起的果腐?。?5］；貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）Hsg1949 菌株的菌懸液也可以顯著降低發(fā)病率，對花生果腐病的防治效果與多菌靈相當［16］；此外，土壤調(diào)理劑改良土壤或用種衣劑拌種，也可以有效降低花生果腐病的發(fā)生［14］。目前尚無花生果實腐爛病化學防控藥劑篩選的報道?！颈狙芯壳腥朦c】花生是廣東最主要的油料作物，近年來栽培面積逐年上升，2020年達到34.67 萬hm2，產(chǎn)量達到112.05 萬t［18］。廣東省花生大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2019 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)粵北地區(qū)花生果腐病發(fā)生嚴重，但病原菌不清楚，缺乏有效的防控藥劑供農(nóng)戶參考?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離并鑒定廣東花生果腐病的病原菌，篩選對病原菌具有較好抑菌效果的殺菌劑，為進一步采取措施減少花生果腐病在廣東的傳播和危害提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集、分離和回接

1.1.1患病花生樣品采集和病原菌分離 2019 年8 月從韶關(guān)市曲江區(qū)樟市鎮(zhèn)采集罹患果腐病的花生樣品，采用常規(guī)組織分離法進行病原菌分離，從果莢的病健交界處取小塊組織，表面消毒后置于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，待長出菌絲后，立即挑取邊緣菌絲到新的PDA 上培養(yǎng)，直至獲得純化的菌株并保藏備用。從花生果腐病樣品中共分離獲得9 株真菌。

1.1.2分離真菌的致病性回接 采用了2 種花生莢果作為回接材料驗證菌株致病性，回接方法參照文獻［6-7］。初篩使用仲愷農(nóng)業(yè)工程學院選育的花生品種仲愷花1 號的干燥莢果為回接材料，將莢果洗凈后無菌水沖洗4 次，再用70%酒精浸泡10 s 消毒，消毒后用無菌水清洗4 次。在超凈工作臺內(nèi)將莢果吹干。將接種針在火焰上灼燒冷卻后，在花生果嘴部位刺5 個小孔，將菌絲塊倒貼刺孔的位置，用濕潤的無菌脫脂棉覆蓋保濕，再用保鮮膜固定。接種5 d 后，觀察各菌株接種后的發(fā)病情況，將發(fā)病癥狀與果腐病癥狀相似的莢果開展病原菌分離，確定9 株真菌中的R4.2 和R5 菌株是致病菌。從韶關(guān)采集新鮮的花生莢果，使用幼嫩莢果和成熟莢果同時進行回接實驗，再次檢查2 株病原菌對不同成熟度花生莢果的致病性。

1.2 病原菌的分子鑒定

1.2.1基因組DNA 制備 使用PDB 培養(yǎng)液培養(yǎng)病原菌，離心獲得菌絲球后，用ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep（貨號D6005，購自ZYMO）制備基因組DNA。

1.2.2ITS1-ITS4 區(qū)PCR 擴增和 序列測定 采用真菌核糖體rDNA 區(qū)的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增待測真菌的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 全序列及部分18S和28S rDNA 序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：2×Taq Plus PCR MasterMix（貨號KT205，購自天根生化科技（北京）有限公司）12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit（貨號D2500，購自O(shè)MEGA）回收純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3系統(tǒng)發(fā)育分析 獲得2 個菌株的序列后，利用BLAST 在線分析軟件在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中比對，挑選其中已公開發(fā)表的菌株序列，用Mega5.1 軟件采 用Maximum-Likelihood（Kimura 2-parameter model,Bootstrap 500）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4藥劑對病原菌的毒力測定 2022 年4 月在仲愷農(nóng)業(yè)工程學院植物健康創(chuàng)新研究院實驗室采用菌絲生長速率法對幾種市售殺菌劑開展室內(nèi)毒力測定［19-20］。供試殺菌劑包括：98%噁霉靈可溶粉劑（天津市綠亨化工有限公司生產(chǎn)）、40%福美雙懸浮劑（廣東植物龍生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）、24%井岡霉素A 水劑（武漢科諾生物科技股份公司生產(chǎn)）、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（先正達南通作物保護有限公司生產(chǎn)）、10%多抗霉素可濕性粉劑（日本科研制藥株式會社生產(chǎn)），藥劑均購于農(nóng)化市場。將藥劑配制成不同濃度梯度，使藥劑有效成分形成濃度梯度（噁霉靈濃度梯度為0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/L，井岡霉素A 濃度梯度為0、1.5、3、6、12、24 mg/L，福美雙濃度梯度為0、0.25、0.5、0.1、0.2、0.4 mg/L，苯醚甲環(huán)唑濃度梯度為0、0.1、1、10 mg/L，多抗霉素濃度梯度為0、0.01、0.1、1 mg/L），將藥劑加入已滅菌的PDA 培養(yǎng)基內(nèi)混合均勻，倒入一次性培養(yǎng)皿中，對照組的培養(yǎng)基中加入無菌水。將病原菌菌餅接種至無藥劑的PDA 培養(yǎng)板及含不同濃度藥劑的PDA 培養(yǎng)板的中心位置，每個處理重復(fù)3 次，培養(yǎng)板放置26℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至對照PDA 培養(yǎng)基中真菌長滿整個培養(yǎng)皿后測量各藥劑處理的PDA 培養(yǎng)基中病原菌的直徑。計算各藥劑對病原菌的平均抑制百分率：

利用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)并求出EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生果腐病發(fā)病癥狀

罹患花生果腐病的植株地上莖葉在大田無癥狀，但是花生莢果和果柄出現(xiàn)腐爛（圖1A），大部分嚴重發(fā)病的花生，果仁也腐爛并出現(xiàn)空殼（圖1B）。果腐病在韶關(guān)十分普遍，但不同地塊的發(fā)病程度有差異，水稻和花生輪作可以減輕病害發(fā)生。果腐病發(fā)生嚴重程度目前尚無統(tǒng)一的評價方式，文獻報道的評價方式主要有2 種，一種是根據(jù)莢果腐爛程度設(shè)置病級并計算病情指數(shù)來統(tǒng)計發(fā)病率，另一種是根據(jù)被害莢果數(shù)占總莢果數(shù)的比例來判斷發(fā)病率。根據(jù)圖1 和田間調(diào)查的情況來看，發(fā)病嚴重時使用發(fā)病率指數(shù)來判斷比較能反應(yīng)實際情況，但在病害發(fā)生情況不嚴重時，病情指數(shù)評價更合適。

圖1 花生果腐病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of peanut pod rot

2.2 病原菌的分離純化

選取典型的罹患果腐病的花生莢果，用PDA培養(yǎng)基分離，經(jīng)過反復(fù)純化后得到9 株真菌分離物，用于進一步的致病性測定。

2.3 病原菌的致病性測定

將獲得的9 株真菌分離物在室內(nèi)進行回接測定，發(fā)現(xiàn)其中2 株真菌R4.2 和R5 回接后引起仲愷花1 號的干燥莢果出現(xiàn)與田間癥狀相似的腐爛癥狀（圖2）。采集田間的新鮮健康莢果進一步測定2 株真菌對不同成熟度花生莢果的致病力（圖3），對照莢果表面消毒后用無菌接種針扎孔，在保濕培養(yǎng)條件下無病害癥狀出現(xiàn)，但R4.2和R5 菌株回接后引起腐爛癥狀，其中R4.2 對幼嫩果實和成熟果實都有致病力，而R5 主要引起幼嫩果實發(fā)病。R4.2 和R5 的菌落形態(tài)如圖4 所示，在27℃培養(yǎng)5 d 可以長滿整個培養(yǎng)皿，菌絲為白色，氣生菌絲豐富。

圖2 2 株真菌菌株回接引起干花生果莢腐爛癥狀Fig.2 Rot symptoms of dry peanut pod caused by 2 fungi strains inoculation

圖3 2 株真菌引起成熟度不同的鮮花生果實腐爛癥狀Fig.3 Rot symptoms of fresh peanut pod in different ripeness caused by 2 fungi strains inoculation

圖4 2 株真菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphologies of 2 fungi strains on PDA medium

2.4 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ITS1 和ITS4 通用引物擴增出長約540 bp 的片段，測序后進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)R4.2菌株的ITS 序列與GenBank 中的茄病鐮刀菌（F.solani）的同源性達到99%以上，R5 菌株與尖孢鐮刀菌（F.oxyspourm）的同源性達到99%以上。從NCBI 的比對結(jié)果中下載已發(fā)表的序列，選擇與尖孢鐮刀菌遺傳距離較近的層出鐮刀菌（F.proliferatum）和與茄病鐮刀菌遺傳距離較近的假劍形鐮刀菌F.pseudensiforme作為內(nèi)參，以里氏木霉菌Trichoderma reesei為外參構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5 所示，R4.2 菌株初步鑒定為茄病鐮刀菌（F.solani），R5 菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxyspourm）。

圖5 基于R4.2 和R5 菌株ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences of R4.2 and R5 strains

2.5 殺菌劑對病原菌的毒力測定

由表1 和表2 可知，在供試的5 種殺菌劑中，苯醚甲環(huán)唑和多抗霉素對2 株花生果腐病病原真菌沒有抑菌活性，但另外3 種殺菌劑，包括井岡霉素A、噁霉靈和福美雙則對2 株病原菌均具有抑菌活性，福美雙的抑菌活性最強，其次是噁霉靈，井岡霉素A 雖然也有抑菌活性，但是EC50較高，達到11.185 mg/L 和20.575 mg/L。

表2 5 種藥劑對尖孢鐮刀菌R5 菌株的毒力測定結(jié)果Table 2 Toxicity test results of 5 fungicides to Fusarium oxysproum stain R5

3 討論

文獻報道廣東地區(qū)花生的真菌性病害主要有葉斑病、銹病、莖腐病、根腐病和冠腐?。?1］、白絹?。?2］以及黑腐?。?3］，還沒有果腐病的報道。花生果腐病最早在美國被發(fā)現(xiàn)，之后許多國家相繼報道了該?。?］，國內(nèi)最早在河北省被發(fā)現(xiàn)，據(jù)調(diào)查該病可能在2000 年左右已經(jīng)開始發(fā)生，是群結(jié)腐霉（P.myriotylum）和茄病鐮刀菌（F.solani）混合感染引起［5］，但鐮刀菌可能是主要的病原［1］。此外，還在河北地區(qū)發(fā)現(xiàn)了新的果腐病病原菌，包括侵脈新赤殼菌N.vasinfecta［9］和N.striata［10］。近年來 在海南也發(fā)現(xiàn)了花生果腐病，初步鑒定也是由鐮刀菌（Fusariumsp.）引起［7］。本研究從廣東韶關(guān)采集的樣本中也僅分離出鐮刀菌，通過致病性回接確定茄病鐮刀菌（F.solani）可能是主要的致病菌，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）主要在幼果期危害，與文獻報道的病原菌以及國內(nèi)其他地方報道的病原菌相似。

花生果腐病的發(fā)生受到氣候、土壤條件和根際微生物群落等的影響。有研究顯示日平均溫度和降雨量的升高顯著加重病害，土壤的粘質(zhì)程度、含水量、連作時長和施肥量等也與病害發(fā)生正相關(guān)［2］。土壤真菌群落結(jié)構(gòu)也與花生果腐病的發(fā)生相關(guān)，鐮刀菌屬Fusarium、毛殼菌屬Chaetomium、鏈格孢屬Alternaria和Sordariomycetes等是患病土壤的優(yōu)勢種［24］，鐮刀菌屬Fusairum和隱球菌屬Cryptococcus的物種在土壤樣品中少，在果腐病樣品中多，是主要的病原菌［25］。

福美雙屬于有機硫類殺菌劑，噁霉靈屬于噁唑類殺菌劑，文獻報道這兩種類型的殺菌劑都對鐮刀菌具有較好的抑制效果［26］，對引起紅花玉蘭根腐病的病原菌F.solani1123-3 菌株的EC50分別為0.029 g/L 和0.129 g/L，本研究測定福美雙對引起花生果實腐爛的F.solaniR4.2 菌株的EC50為0.021 mg/L，噁霉靈對R4.2 的EC50也遠低于文獻，可能與不同的菌株對藥劑的敏感度不同有關(guān)。文獻報道［27］井岡霉素對引起黨參根腐的F.solaniCQ-4 菌株的EC50為0.095 g/L，對CQ-13 菌株的EC50為0.457 g/L，但本研究測定井岡霉素A 對F.solaniR4.2 的EC50為11.185 mg/L，低于文獻報道的濃度，出現(xiàn)這種差異可能與測試菌株不同以及藥劑劑型有關(guān)。此外，文獻報道多抗霉素［27］和苯醚甲環(huán)唑［28］對鐮刀菌具有抑菌活性，但本研究測定的多抗霉素和苯醚甲環(huán)唑?qū)σ鸹ㄉ〉腇.oxysporumR5 和F.solaniR4.2 均無抑菌活性，可能與不同測試菌株對藥劑的敏感性存在差異有關(guān)。

花生果腐病是土傳病害，單一的防控措施可能難以持續(xù)湊效，未來需要對花生果腐病開展綜合防控技術(shù)研究和集成，結(jié)合抗病品種篩選、土壤調(diào)理劑應(yīng)用、種衣劑應(yīng)用和生物防治產(chǎn)品應(yīng)用等構(gòu)建綠色防控技術(shù)體系，推動花生產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究首次報道了廣東花生果實腐爛病的為害，目前該病已經(jīng)在粵北地區(qū)廣泛發(fā)生，應(yīng)引起重視。研究結(jié)果表明韶關(guān)采集的病樣是由鐮刀菌復(fù)合感染引起的，經(jīng)鑒定病原菌為茄病鐮刀菌（F.solani）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），茄病鐮刀菌的致病力強，可以同時感染幼果和成熟的花生果莢，而尖孢鐮刀菌的致病力則較弱，主要引起幼果發(fā)病。室內(nèi)藥劑篩選顯示福美雙對茄病鐮刀菌R4.2 菌株的EC50為0.021 mg/L，對尖孢鐮刀菌R5 菌株的EC50為0.001 mg/L，噁霉靈對茄病鐮刀菌R4.2 菌株的EC50為0.217 mg/L，對尖孢鐮刀菌R5 的EC50為0.296 mg/L，可以用于花生果實腐爛病的防控，但施用方式和田間防效還有待進一步研究。