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    左歸丸對(duì)早衰和初老大鼠下丘腦-垂體-卵巢FSHR、LHR和ER表達(dá)的影響

    2022-10-12 01:20:04趙粉琴趙艷劉潔穎茍雅姣胡芝霞
    中醫(yī)藥學(xué)報(bào) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:左歸丸下丘腦垂體

    趙粉琴,趙艷,劉潔穎,茍雅姣,胡芝霞

    (甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000)

    下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO)調(diào)控卵巢的生殖和內(nèi)分泌功能,下丘腦分泌促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRHa),促進(jìn)垂體前葉分泌促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH),F(xiàn)SH的生物學(xué)作用主要是促進(jìn)卵巢卵泡的生長(zhǎng)和卵泡顆粒細(xì)胞的增生,刺激卵泡細(xì)胞上LH受體產(chǎn)生;LH的生物學(xué)作用主要是促進(jìn)卵泡的成熟和排卵,刺激卵泡內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生雌激素,維持女性?xún)?nèi)分泌。

    FSHR和LHR主要存在于卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞,是促性腺激素(Gn)及各類(lèi)細(xì)胞因子調(diào)控卵泡發(fā)育、成熟及排卵的重要受體,GnRHa能抑制FSH對(duì)FSHR的誘導(dǎo)[1],從而使卵巢FSHR表達(dá)及FSHR與FSH的結(jié)合量減少[2],影響卵泡的發(fā)育和成熟,但是在FSHR和LHR下丘腦和垂體組織的表達(dá)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。左歸丸作為經(jīng)典補(bǔ)腎藥[3],在防治生理性或功能性卵巢功能衰退(POF)方面研究較多,對(duì)下丘腦-垂體-卵巢激素受體表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道?;诖吮狙芯繉?duì)不同階段大鼠體內(nèi)血清(FSH、LH和E2)水平變化以及在下丘腦、垂體、卵巢不同部位表達(dá)的差異性以及左歸丸的干預(yù)作用進(jìn)行研究,驗(yàn)證左歸丸促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    雌性SPF級(jí)SD大鼠,4~6月齡(青年,相對(duì)于人18~20歲)60只,11~12月齡(初老,相對(duì)于人40~45歲)40只,體質(zhì)量(220±20)g。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(甘)2015-0005。普通飲食、飲水,室溫18~25 ℃,相對(duì)濕度60%~70%,自然晝夜節(jié)律光照。

    1.2 主要藥品和試劑

    順鉑注射液(云南植物藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H53021740);補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009);性激素ELSIA試劑盒,LH(MM-0624R1)、FSH(MM-0566R1)、E2(MM-0575R1)均來(lái)自江蘇菲亞生物科技有限公司;一抗(GeneTex):LHR(GTX64387,稀釋比例為1∶100,抗兔),F(xiàn)SHR(GTX64391,稀釋比例為1∶100,抗兔),ER(GTX22746,稀釋比例為1∶100,抗鼠);DAB顯色試劑盒(中杉金橋);二抗(中杉金橋):生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG(SP-9002),生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(SP-9001);三抗(中杉金橋),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(SP-9001)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備、分組以及給藥

    青年大鼠60只給予順鉑注射液6 mg/(kg·w),共2次,建立卵巢早衰大鼠模型??瞻捉M給予等劑量的生理鹽水腹腔注射。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、模型+補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸(低、中、高)劑量組,每組10只;另40只初老大鼠,隨機(jī)分成空白組,初老+左歸丸(低、中、高)劑量組,每組10只。補(bǔ)佳樂(lè)灌胃藥物劑量0.09 g/(kg·d),制備成0.09 mg/mL;左歸丸劑量9.45 g/(kg·d),制備左歸丸濃度煎劑為0.945 g生藥/mL,低劑量0.472 5 g生藥/mL,中劑量0.945 g生藥/mL,高劑量4.725 g生藥/mL。左歸丸組成為熟地黃、炒山藥、山萸肉、牡丹皮、澤瀉、茯苓,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供,每只大鼠灌胃2 mL/d,連續(xù)用藥21 d。

    1.4 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法

    1.4.1 大鼠血清性激素水平的檢測(cè)

    治療結(jié)束后,心前區(qū)取血1.5 mL,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清移入EP管,用96孔ELISA試劑盒檢測(cè)血清中FSH、E2和LH水平。

    1.4.2 免疫組化法檢測(cè)大鼠下丘腦、垂體、卵巢組織中FSHR、LHR、ER蛋白表達(dá)

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束,處死大鼠,分離下丘腦、垂體、卵巢,切片,脫水。3 %過(guò)氧化氫室溫避光作用20 min。正常山羊血清封閉液室溫作用30 min。倒去封閉液,滴加一抗(FSHR或LHR或ER)工作液(1∶100),4 ℃ 孵育過(guò)夜。分別滴加生物素化二抗(SP試劑盒)、三抗,分別室溫作用30 min,再滴加DAB顯色液(1∶20),室溫避光作用5 min,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,一旦出現(xiàn)最佳顏色,使用蒸餾水停止其顯色反應(yīng),蘇木素復(fù)染,酒精脫水,中性樹(shù)膠封片。同時(shí)設(shè)染色對(duì)照,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域。使用Image-Pro Plus軟件(6.0版)測(cè)量卵巢內(nèi)組織中FSHR、LHR、ER陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(IOD)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠血清FSH、LH和E2含量變化

    實(shí)驗(yàn)過(guò)程中除正常組以外,其余各組有大鼠死亡。與空白組比較,早衰模型組大鼠血清FSH增高(P<0.01),LH增高,E2降低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,模型+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.01);與初老組比較,初老組+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠血清FSH、LH和E2含量

    2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR、LHR和ER表達(dá)分析

    2.2.1 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達(dá)分析

    與空白組比較,模型組、初老組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR表達(dá)下降(P<0.01,P<0.05);與模型組比較,補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸高劑量組、初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織的FSHR表達(dá)增加(P<0.01,P<0.05);與初老組比較,初老+左歸丸高劑量組明顯增加下丘腦、垂體、卵巢組織FSHR表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2,圖1。

    表2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達(dá)分析

    圖1 下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR免疫組化表達(dá) (×400)

    2.2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達(dá)分析

    與空白組比較,模型組、初老組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達(dá)下降(P<0.01,P<0.05);與模型組比較,補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸(中、低劑量組)和初老+左歸丸低劑量組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達(dá)明顯降低(P<0.01),而模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織LHR表達(dá)明顯增加(P<0.01);與初老組比較,左歸丸(高、中劑量組)明顯增加大鼠垂體組織LHR表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3,圖2。

    表3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達(dá)分析

    2.2.3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達(dá)分析

    與空白組比較,模型組大鼠下丘腦和卵巢組織、初老組大鼠下丘腦和垂體組織ER表達(dá)下降(P<0.01);與模型組比較,初老組、模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸(高劑量)低大鼠下丘腦、模型+左歸丸(高、中劑量組)和初老+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體和卵巢組織ER表達(dá)明顯增加(P<0.01);與初老組比較,初老組+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體組織ER表達(dá)明顯增加(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表4,圖3。

    表4 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達(dá)分析

    圖3 下丘腦、垂體和卵巢組織ER免疫組化表達(dá)(×400)

    3 討論

    POF主要是卵泡數(shù)量減少,雌激素水平下降,出現(xiàn)一系列近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥,嚴(yán)重影響女性生殖、生命健康[4]。女性生殖和內(nèi)分泌功能由HPO軸的正負(fù)反饋調(diào)控,F(xiàn)SH和LH,優(yōu)先激活它們?cè)谙虑鹉X-垂體-卵巢-子宮性腺軸中的同源受體發(fā)揮重要作用[5-6],促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟以及排卵,同時(shí)卵泡發(fā)育合成的E2,與其富含ER的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織[7]結(jié)合發(fā)揮作用[3]。所有激素在體內(nèi)生理作用的強(qiáng)弱,除了與生物效應(yīng)量呈正比,還受激素受體(R)活性度高低的影響[8]。

    FSHR和LHR對(duì)卵巢卵泡的發(fā)育、成熟以及排卵起著重要調(diào)控作用,而且不受外源性雌激素含量的影響[9]。關(guān)于雌激素及其受體結(jié)合,在生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等發(fā)揮重要作用的報(bào)道很多[10-11],尤其是FSHR和LHR是卵巢顆粒細(xì)胞膜表面的重要受體,兩者的表達(dá)水平與卵母細(xì)胞的成熟程度呈現(xiàn)正相關(guān)[12],在相同年齡的情況下,ER水平低下其卵巢衰老更快,其功能退化更為明顯,反作用于腺垂體,腺垂體減少促卵泡素分泌[13]。研究認(rèn)為FSHR 的缺陷會(huì)導(dǎo)致受體結(jié)合FSH 以及信號(hào)傳導(dǎo)的異常,配子生成障礙,導(dǎo)致不孕[14],因而研究卵巢功能早衰(POF)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸上FSH受體(FSHR)、LH受體(LHR)以及雌激素受體(ER)含量變化就顯得尤為重要。

    本研究采用順鉑腹腔注射致POF[15],血清性激素水平結(jié)果顯示,早衰大鼠和初老大鼠血清FSH增高(P<0.05),LH增高,E2含量降低,但各組雌激素水平比較之間無(wú)差異(P>0.05),因?yàn)榇萍に夭皇桥袛嗦殉补δ芩ネ说闹饕笜?biāo)[16]。經(jīng)治療后發(fā)現(xiàn)左歸丸能減少早衰和初老大鼠FSH和LH分泌,升高E2水平,促進(jìn)各級(jí)卵泡發(fā)育,達(dá)到改善卵巢功能的目的,尤以左歸丸高劑量組作用顯著(P<0.05)。

    通過(guò)免疫組化的組織病理學(xué)研究顯示,早衰大鼠和初老組大鼠下丘腦組織中FSHR和LHR表達(dá)明顯下降(P<0.05),而初老組大鼠ER表達(dá)沒(méi)有下降。早衰大鼠和初老組大鼠垂體組織中LHR表達(dá)明顯下降(P<0.05),而早衰大鼠FSHR沒(méi)有明顯變化,ER表達(dá)下降(P<0.05);初老組大鼠FSHR表達(dá)明顯下降(P<0.05),而ER沒(méi)有明顯變化。在卵巢組織早衰大鼠FSHR和ER表達(dá)明顯下降(P<0.05),而LHR沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明卵巢功能衰退FSH和LH效應(yīng)組織的相應(yīng)FSHR和LHR含量表達(dá)減少早于雌激素受體。這與研究卵巢上位腺體功能的異常可能先于卵巢功能的衰退有關(guān),與血清雌激素水平無(wú)關(guān)一致[17]。

    因?yàn)橄虑鹉X是雌激素正負(fù)反饋?zhàn)饔靡约按贵w負(fù)反饋?zhàn)饔玫男?yīng)器,早衰和初老大鼠血清FSH和LH水平升高,雌激素水平下降,進(jìn)而反饋性影響下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR、LHR和ER含量,F(xiàn)SH、LH和雌激素作用強(qiáng)度降低,卵母細(xì)胞停止發(fā)育及閉鎖,雌激素合成下降,即POF狀態(tài)。

    左歸丸作為經(jīng)典補(bǔ)腎養(yǎng)血方劑,具有填精益髓功效[18],切合腎主生殖,腎精虧虛乃天癸竭,形壞而無(wú)子之病機(jī)。本研究顯示左歸丸能上調(diào)下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR和ER表達(dá),提高FSH和雌激素作用效度,改善卵巢功能的作用。這可能與左歸丸有類(lèi)雌激素樣作用,并能增加雌激素效應(yīng)組織受體含量,促進(jìn)雌激素與其特異性受體的結(jié)合,改善卵巢功能,同時(shí)是否與左歸丸有改善化療引起的氧化應(yīng)激損傷,延緩衰老有關(guān)[19]。

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