新疆陸9井區(qū)砂巖油藏廉價營養(yǎng)體系篩選與評價*

王紅波，連澤特，曹 強，范賽華，劉曉麗，馬 挺

（1.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，新疆克拉瑪依 834000；2.中國石油新疆油田分公司陸梁油田作業(yè)區(qū)，新疆克拉瑪依 834000；3.南開大學生命科學學院，天津 300071）

新疆陸梁油田位于準噶爾盆地腹部古爾班通古特沙漠北部。其中，陸9 井區(qū)某油藏為具有基本統(tǒng)一油水界面的薄層、低幅度、高滲透和邊底水砂巖油藏。隨著采出體積的增大，注水量增幅較小，注采比不斷下降。根據(jù)該油藏特征與儲層物性，結合油水井動態(tài)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)儲層非均質性嚴重，導致油藏平、剖面矛盾突出，同時受油藏邊底水和CaCl2水型的限制，有效提高采收率的方法比較單一，增產措施少。這樣的砂巖油藏在新疆油田具有一定的代表性，目前從整體上還缺少抑制含水上升的有效技術手段。然而油藏剩余儲量豐富，因此尋找新的技術手段就成了該區(qū)塊提高油藏采收率和穩(wěn)油控水的主要途徑。

微生物采油技術是生物工程技術在油田開發(fā)領域的應用，具有低成本、適應性強、作業(yè)簡單、無環(huán)境問題等優(yōu)勢［1］。微生物驅油技術即通過注入采油功能菌及其營養(yǎng)激活劑，使其在油藏中產生代謝作用和代謝產物，并與原油/巖石/水相互作用，從而提高水驅效率，達到提高油藏最終采收率的目的，具有油藏適應好、作用途徑多、協(xié)同作用強、工藝簡單、成本低等優(yōu)勢［2］。激活劑是決定微生物驅油效果的重要因素之一。因此，本文以工業(yè)發(fā)酵副產品和農業(yè)廢棄物為激活劑的主要原料，篩選評價了適合于陸9 井區(qū)油藏的激活體系配方，定向激活油藏中的主要采油功能菌，發(fā)揮微生物驅的優(yōu)勢，實現(xiàn)陸9井區(qū)油藏的穩(wěn)油控水和經濟有效開發(fā)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

豆餅粉、C1（農副產品加工廢料，有機氮質量分數(shù)7.31%）、C2（農副產品加工廢料，有機碳質量分數(shù)20.21%）、豆粕、顆粒狀肥料等，工業(yè)級，天津市利發(fā)隆化工科技有限公司；乙酸鈉、紅糖、蔗糖、甘油、N1（含氮無機鹽，含氮量26.16%）、N2（含氮無機鹽，含氮量16.47%）、尿素、磷酸氫二胺、磷酸二氫銨、正十二烷，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；熒光定量PCR 分析試劑組成：溶菌酶、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris 飽和酚、氯仿、乙醇、Roche 熒光定量試劑盒，北京鼎國生物技術有限責任公司；超純水；PCR 引物，北京奧科生物技術有限責任公司；環(huán)氧樹脂膠結驅油用巖心，取自中國石油新疆油田分公司巖心庫；油水樣采集自新疆某砂巖油藏油田陸9井區(qū)某一層位油藏，地層水礦化度10298.89 mg/L，主要由Na+、Cl-、HCO3-等離子組成。

ZQZY-70 BS 搖床，上海知楚儀器有限公司；Yamato SQ 510 C 滅菌鍋，日本大和科學株式會社；JJ-4 A 水浴鍋，金壇市城東新瑞儀器廠；Vortex 2 振蕩器，美國Scientific Industries公司；BCD-195冰箱，河南新飛電器集團有限公司；物模驅油裝置、HKY-1型巖石超聲波綜合測試儀，海安石油科研儀器公司；氮氣瓶；不銹鋼耐壓容器1、2 L各1個；油水分離計量器，天津市泰源工業(yè)氣體有限公司；MyuQTM2 Opitics Module 實時熒光定量PCR 儀、Bio-Rad iQ 5 PCR，美國伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；JIN26 高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）有限公司；Universal 320 R臺式高速冷凍離心機，德國Hettich科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

微生物提高原油采收率主要通過微生物本身及其代謝產物兩方面作用［3］。為了便于室內激活體系配方的優(yōu)化，依據(jù)激活劑激活效果評價方法，本著簡單易行、有效合理的原則，確立了以激活前后水樣總菌數(shù)變化、硫酸鹽還原菌（SRB）數(shù)量變化和對原油的乳化作用效果作為評價激活效果的主要指標。

（1）乳化評級方法

激活劑乳化評級方法參照代學成等［4］描述的油水乳化效果評分標準，主要觀察微生物激活培養(yǎng)后分散乳化原油的能力。該方法簡單易行，用肉眼根據(jù)經驗判定營養(yǎng)配方的乳化效果，判定結果存在人為因素的誤差［5］。

（2）排油圈法

排油圈法是公認的簡便準確的評估樣品乳化效果的實驗方法［6］。具體步驟為：在培養(yǎng)皿（直徑=90 mm）中加入60 mL的熱水，再加入10 mL經蘇丹Ⅲ染色的正十二烷（需過濾除菌）；待正十二烷鋪滿整個平板后，在其表面加入1 mL 待測樣品，用刻度尺測量排油圈直徑大小，若排油圈直徑大于3 cm，即認為培養(yǎng)液中存在表面活性劑。

（3）熒光定量PCR方法

熒光定量PCR 是通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［7］。對于油藏環(huán)境而言，烴氧化菌、硝酸鹽還原菌及表面活性劑產生菌這幾類功能微生物與微生物采油技術密切相關，因此定量分析這些功能基因有助于更加清晰地認識和判斷油藏環(huán)境中的微生物群落。選擇與原油乳化分散效果密切相關的編碼鼠李糖脂的鼠李糖基轉移酶rhlAB基因、脂肽類表面活性劑合成酶srfA基因、與烷烴降解相關的烷烴加氧酶alkB基因進行群落相關功能菌的定量PCR分析。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

因編碼烷烴加氧酶的alkB基因包含細胞色素P450氧化酶和細菌顆粒狀烷烴羥化酶兩大類，因此在設計alkB基因的PCR引物時，需設計多對特異性引物及接頭引物。用實驗室構建的CPY153標準質粒繪制標準曲線，以設置優(yōu)化出最佳的多對特異性引物添加量以及接頭引物的添加量，具體設計方法和15 對引物序列見參考文獻［8］，擴增運行程序見表2。其中，16S rRNA、srfA、rhlAB基因的體系組成為：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL超純水、引物1 和引物2 各0.05 μL、1 μL DNA 模板；alkB 基因的體系組成為：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL 超純水、0.05 μL 引物、1 μL DNA 模板。其中，alkB基因體系配制的第1步按表2進行；第2步在每個體系中加入0.8 μL 的接頭引物（JP），用臺式高速冷凍離心機混勻后使用熒光定量PCR儀進行定量分析。

表2 4類功能基因PCR擴增運行程序

（4）Plackett-Burman實驗

參照參考文獻［9］進行Plackett-Burman（簡稱P-B）實驗。P-B實驗設計建立在平衡的非完全區(qū)組基礎上，通過N個實驗（N為4的倍數(shù)）來分析N-1個變量的兩水平實驗設計方法。和傳統(tǒng)的單因素實驗相比，可以利用最少的實驗次數(shù)快速有效地在眾多考察因素中列出重要性排名，找出主要影響因素。

在初步優(yōu)化營養(yǎng)劑配方的基礎上，利用Minitab軟件（美國賓夕法尼亞州州立大學）進行P-B實驗設計［10］。選 擇 Stat＞Factorial＞Analysis Factorial Design，生成的實驗設計如表3 所示。依照Minitab設計的12水平配方進行顯著性分析實驗，每個水平設置3 個平行，在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)7 d。實驗結束后，取2 mL 激活后的油水樣提取基因組，采用熒光定量PCR技術對基因組中的rhlAB和srfA進行定量分析。

表3 Plackett-Burman實驗設計表

（5）物模驅油實驗

參照常規(guī)的物模驅油實驗［11］，向巖心中注入地層水，直至出口含水率為98%為止，記錄出水量、出油量以及相對應的時間與壓力。第1次水驅結束后注入0.5 PV 菌株發(fā)酵液，注入速度為1 mL/min，密封巖心夾持器后培養(yǎng)7 d，再將地層水注入巖心，直至出口含水率為98%為止，計算提高采收率值。

2 結果與討論

2.1 廉價營養(yǎng)體系的初篩及單因素實驗

根據(jù)油藏水質分析結果、微生物群落組成和生長的營養(yǎng)需求，結合當前國內外已報道的激活體系組成，以及現(xiàn)場配方的組成分析（0.275% C2、0.125% C1、0.6% N2、0.25% N1），確定基礎配方為0.25%C2、0.2%豆餅粉、0.25%N1、0.6% N2。綜合考慮激活體系篩選原則和激活對象的實際情況，以碳源、氮源、磷源、生長因子和SRB 抑制因子為出發(fā)點，進行單因素實驗初步確定基礎激活配方。用250 mL三角瓶進行好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉速為180 r/min，培養(yǎng)時間7 d。培養(yǎng)結束后進行乳化性能評價和功能菌的檢測?？梢愿鶕?jù)激活體系激活后的原油乳化效果及功能菌激活的總菌數(shù)評價激活體系的好壞［4］。

碳源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎上，以乙酸鈉、紅糖、C2、蔗糖、甘油、原油（唯一碳源）為碳源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結果表明，乙酸鈉和C2的激活效果最好，激活后油水樣微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)達到了1012copies/mL以上，乳化評級也達到+++（+的數(shù)量對應于參考文獻［4］中乳化評級方法的0～5 分）；蔗糖、紅糖的激活效果稍差，乳化評級為++；甘油和原油的激活效果最差，乳化評級為+。

氮源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎上，以N1、N2、豆餅粉、C1、尿素、豆粕為氮源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結果表明，N1、N2、豆餅粉、C14 組氮源的微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)均達到了1012copies/mL 以上，乳化評級達到+++（C1為++++）。尿素、豆粕的激活效果較差，乳化評級為+。

磷源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎上，以顆粒狀肥料、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、C1為磷源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結果表明，磷酸氫二胺、磷酸二氫銨等無機磷源（添加量為0.2%）與陸9井區(qū)氯化鈣型地層水形成不溶性沉淀，會造成地層堵塞，無法應用于該區(qū)塊的激活。C1、顆粒狀肥料2種磷源都達到了出色的乳化效果，微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)大于1012copies/mL，乳化評級為++++。

綜合單因素實驗結果和激活配方篩選原則，確定初步配方為：0.10%C1、0.25%C2、0.15%顆粒狀肥料、0.6%N2、0.3%N1。

2.2 Plackett-Burman實驗

依據(jù)表3 設計開展營養(yǎng)劑激活實驗，培養(yǎng)結束后提取基因組，對rhlAB和srfA進行定量分析，將上述功能基因拷貝數(shù)輸入軟件獲得乳化效果綜合得分擬合方程：

在Minitab軟件菜單中選擇Stat＞Facterial＞Facterial Plots，生成各因素對輸出變量（Y值）的影響圖。通過分析主要影響圖可知各因素的顯著性［10］，結果見表4。

由表4 可見，C1、顆粒狀肥料的效應為正，加量增大對乳化效果為正響應，即適當增大加量可提高乳化評級分數(shù)；C2、N2、N1的效應為負，加量減少對乳化效果為正響應，即適當減少加量可提高乳化評級分數(shù)。但5 個營養(yǎng)因子的P值不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此無法通過Plackett-Burman實驗得出各營養(yǎng)因子對乳化效果的顯著性結果。

表4 響應值（乳化評分）的估計效應和系數(shù)

在顆粒狀肥料加量為0.1%時能有效激活陸9井區(qū)地層水中的功能微生物，激活后的油水樣品能達到良好的乳化效果。顆粒狀肥料來源為工業(yè)肥料回收再利用，雖然價格低廉，激活效果良好，但顆粒為直徑3～5 mm的實心球狀體，溶解較為困難，而碾碎溶解后，有較多不溶性片狀雜質（長度約為5 mm），在地層中易造成非選擇性封堵。因此，在后續(xù)實驗中，不再使用顆粒狀肥料進行實驗。而C1含磷量為2.4%，在單因素結果中，C1作為磷源表現(xiàn)了良好的乳化效果，因此在后續(xù)實驗中使用C1作為磷源。

2.3 去因子實驗

2.3.1 營養(yǎng)配方設計

由于不同水平的營養(yǎng)因子添加量下，激活后樣品總菌數(shù)和功能基因的數(shù)量級無顯著性差異（P＜0.05），無法準確判斷各因素的最佳水平。另外，考慮工業(yè)成本的可行性，由單因素實驗得到的初步配方出發(fā)，在Plackett-Burman 實驗的基礎上進行更為直觀的去因子實驗，在保證激活效果的同時節(jié)約成本，實現(xiàn)最優(yōu)的資源利用。設計的7 組配方見表5。在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后進行乳化評級、功能基因定量PCR分析。

表5 去因子實驗營養(yǎng)配方組成

2.3.2 營養(yǎng)配方優(yōu)化結果

用乳化評級和排油圈法共同測定不同營養(yǎng)配方的乳化效果，結果見表6。配方C 的乳化效果最好，排油圈直徑4.0 cm。

表6 7組營養(yǎng)配方去因子實驗結果

用實時熒光定量PCR 技術分別測定7 組營養(yǎng)配方的16S rRNA 基因、alkB基因、srfA基因、rhlAB基因，分別測定解烴基因、脂肽基因、鼠李糖脂基因的拷貝數(shù)，結果見表7。

表7 實時熒光定量檢測功能基因拷貝數(shù)

綜上，7組去因子實驗激活結果表明，配方C和配方G 的激活效果顯著，無沉淀與不溶性雜質出現(xiàn)，配方與水樣的配伍性良好，乳化評級均為5 分。功能基因定量結果顯示解烴菌alkB基因均達到了107copies/mL，脂肽產生菌srfA基因均達到了105copies/mL，鼠李糖脂產生菌rhlAB基因均達到了104copies/mL。

2.4 響應面分析結果

響應面法是通過近似構造一個具有明確表達形式的多項式來表達因式功能的函數(shù)［12］。借助Minitab 5.0 軟件，采用二次回歸的旋轉中心組合設計，進行實驗設計和激活體系配方優(yōu)化。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，對擬合方程作顯著性檢驗和方差分析［13］。選擇 配方C，并 以0.15% C1、0.6% N2、0.25% N1作為0 水平進行3 因素20 水平響應面分析。分析結果（表8）表明，C1和N1為負響應因素，可適當減少添加量；而N2為正響應因素，可適當增加添加量。

為了更為準確地評估不同水平的添加量響應結果，進行了20 水平的熒光定量PCR 分析（圖1）。實驗結果表明，20水平的配方加入量對功能基因數(shù)量級的響應在1個數(shù)量級之內，表明3個因素的3個水平任意組合均不會對激活效果造成較大波動。N2不僅作為優(yōu)良氮源，同時還可以促進硝酸鹽還原菌的生長代謝。由于硝酸鹽還原菌的生態(tài)位在硫酸鹽還原菌之上，且硝酸鹽還原菌的適當富集可以有效抑制硫酸鹽還原菌的生長，因此不降低N2的添加量。C1作為輔助氮源之外，更重要的作用是提供微生物生長代謝所必須的磷源（C1中的無機磷含量為0.7%），因此不降低C1的添加量。與0 水平的N1（0.25%）相比，低水平N1（0.2%）的激活效果及功能基因的數(shù)量級并無明顯差異，因此可以適當降低N1的加量。當N1的加量為0.25%時，配方成本為27.43元/方，已較現(xiàn)場配方降低了20.25%。為了更好地確保激活效果，N1的加量不再降低。最終激活體系配方為：0.15%C1、0.6%N2、0.25%N1。與徐兵等［13］對陸9 井區(qū)內源微生物優(yōu)化后的激活配方相比，成本已大大降低。

圖1 熒光定量PCR 16S rRNA、srfA、rhlAB、alkB基因每毫升拷貝數(shù)

2.5 物模驅油結果

模擬陸9 井區(qū)油藏條件開展物理模擬驅油實驗，結果見表9。當優(yōu)化配方注入量為0.1～0.6 PV時，驅油效率提高2.65 百分點～5.92 百分點。在注入0.6 PV 的實驗過程中，注入量達到0.55 PV 時出現(xiàn)激活體系突破。從物理模擬提高采收率效果來看，0.6 PV提高驅油效率5.92百分點，僅比0.4 PV多0.55 百分點。表明在驅替突破后，后續(xù)激活劑的注入并沒有進一步提升地層微生物乳化原油的能力，而突破后的激活體系則造成浪費，因此選擇0.4 PV作為最佳注入量。在相同條件（0.4 PV，優(yōu)化配方）下，進行注氣量的優(yōu)化實驗。優(yōu)化配方不注氣的條件下提高驅油效率5.37百分點。優(yōu)化配方注氣（氣液體積比8∶1）的條件下提高驅油效率11.65 百分點，高于代學成等［4］制定的激活配方篩選評價指標（6百分點～9百分點）。

表9 物模驅油實驗結果

2.6 現(xiàn)場應用

陸9 油藏微生物驅先導試驗于2017 年11 月開始現(xiàn)場實施，應用的營養(yǎng)體系為本文所篩選的激活體系。試驗區(qū)4 口注入井，設計注入營養(yǎng)體系21.75×104m3（折算孔隙體積0.1 PV），預計增油4.98萬噸，提高采收率3.5%。截至2020 年10 月25 日，試驗區(qū)注劑15.13×104m3。完成總方案的69%。目前現(xiàn)場試驗效果處于高峰期，陸9 微生物驅礦場試驗累積核實增產1.8×104t，階段提高采收率1.3%，平均單井日產油3.1 t，微生物驅效果明顯。

3 結論

針對陸9井區(qū)砂巖油藏主要采油功能菌的營養(yǎng)需求，篩選出一套高效而廉價的營養(yǎng)體系。該體系乳化原油效果較好，激活主要采油功能基因烴氧化基因達到107copies/mL，脂肽產生菌srfA基因均達到了105copies/mL，鼠李糖脂產生菌rhlAB基因均達到了104copies/mL；物模驅油實驗提高采收率11.65百分點。

體系選取工業(yè)發(fā)酵副產品和農業(yè)廢棄物為激活劑的主要原料，與現(xiàn)場在用配方相比，注入藥劑成本顯著降低20.25%。配方成分廉價易得、便于運輸和儲存，適合油田低成本開發(fā)的需要，具有良好的應用價值。

通過單因素試驗、Plackett-Burman實驗、去因子實驗、響應面實驗等，并結合微生物激活評價方法，形成一套微生物激活劑篩選評價方法流程，為今后開展微生物驅激活劑篩選評價提供借鑒。