益生元對(duì)HCT- 8細(xì)胞炎癥和樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響

顏毛毛， 徐笑非， 彭思敏， 吳少輝， 郝占西， 魏遠(yuǎn)安,*

(1.量子高科(廣東)生物有限公司， 廣東 江門(mén) 529081；2.華南理工大學(xué) 生命科學(xué)研究院， 廣東 廣州 510006)

益生元是一類選擇性地被宿主微生物吸收代謝，從而賦予宿主有益影響的化合物。益生元已被廣泛用于保健食品添加以調(diào)節(jié)機(jī)體代謝或增強(qiáng)機(jī)體免疫力，近期也被用于臨床上干預(yù)和預(yù)防許多免疫相關(guān)疾病[1-3]。由于目前認(rèn)為益生元主要通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物的組成及代謝，依賴其代謝產(chǎn)物(比如短鏈脂肪酸)作用于宿主細(xì)胞，從而激活相關(guān)分子通路發(fā)揮調(diào)節(jié)宿主代謝或免疫功能作用[4-5]，且增殖雙歧桿菌和乳酸桿菌一直以來(lái)都作為判斷是否為益生元的標(biāo)準(zhǔn)[6]，不同的益生元往往被認(rèn)為具有相同或相似的功能。因此，目前實(shí)際應(yīng)用中益生元往往被當(dāng)作類似物使用。然而越來(lái)越多的研究表明益生元除了通過(guò)腸道菌群間接發(fā)揮作用以外，還可以直接作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥和增強(qiáng)免疫作用[7-8]。雖然不同益生元通過(guò)腸道菌群發(fā)揮的功效具有一定的相似性，其直接作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮的功效是否也類似目前所知甚少。另外，很多應(yīng)用實(shí)例表明：在應(yīng)用這些益生元預(yù)防或干預(yù)某些疾病時(shí)，并不是所有的益生元都有很好的效果，同一種益生元也不是對(duì)所有人群有效，暗示不同的益生元可能有不同的功效，適合應(yīng)用的特征人群也可能不同。為此，益生元精準(zhǔn)化應(yīng)用的概念應(yīng)運(yùn)而生，即通過(guò)深入研究不同益生元的生理作用機(jī)制，針對(duì)不同人群或個(gè)體的菌群、疾病狀態(tài)、代謝、營(yíng)養(yǎng)特征和需求，以獨(dú)立或協(xié)同作用的方式，實(shí)現(xiàn)益生元在健康產(chǎn)品、生物醫(yī)藥研發(fā)、醫(yī)療服務(wù)上的精準(zhǔn)化定制和科學(xué)配方[9]。為了實(shí)現(xiàn)益生元的精準(zhǔn)化，就必須從細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的層面研究清楚各種益生元的生理功能及機(jī)制。

由于益生元進(jìn)入人體腸道之后能夠直接作用于人體的腸上皮細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[10]，且小鼠及臨床上的數(shù)據(jù)表明某些益生元對(duì)于腸道屏障功能紊亂及炎癥性腸病有較好地緩解作用[11-13]。而腸上皮細(xì)胞在致病菌刺激下的炎癥響應(yīng)及樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟與炎癥性腸病的發(fā)展息息相關(guān)[14]，因此，本研究將探討目前市場(chǎng)上可售的6種益生元[蔗果三糖(1-kestose，GF2)、2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose，2′-FL)、低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)、低聚甘露糖(mannooligosaccharides，MOS)及菊粉(Inulin)]對(duì)于由出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)引起的人腸上皮細(xì)胞炎癥響應(yīng)及人樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響，旨在為益生元的精準(zhǔn)化應(yīng)用提供指導(dǎo)方向及數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腸上皮HCT- 8細(xì)胞系(產(chǎn)品編號(hào)CCL- 244)、EHEC(enterohemorrhagicE.coli，菌株O157:H7，產(chǎn)品編號(hào)ATCC43894)，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(產(chǎn)品編號(hào)16000044)，美國(guó)Gibco公司；RPMI- 1640培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)PM150110)，武漢Procell公司；GF2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85%)、2′-FL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)、FOS(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)及GOS(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)，江門(mén)量子高科(廣東)生物有限公司；MOS(低聚甘露糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)，恩施天天佳生物科技有限公司；Inulin(菊粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥92%)，比利時(shí)Beneo- Orafti公司。

phospho- NF- κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb(產(chǎn)品編號(hào)3033)、NF- κB p65 (L8F6) Mouse mAb(產(chǎn)品編號(hào)6956)、I- κB- α(L35A5) Mouse mAb(產(chǎn)品編號(hào)4814)、GAPDH(14C10) Antibody(產(chǎn)品編號(hào)2118)，美國(guó)Cell Signalling Technologies公司；Pacific BlueTManti-human CD11b Antibody(產(chǎn)品編號(hào)101224)及APC anti-human CD83 Antibody(產(chǎn)品編號(hào)305312)，美國(guó)BioLegend公司；免疫印跡所用二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(產(chǎn)品編號(hào)G- 21040)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(產(chǎn)品編號(hào)G- 21234)，美國(guó)Thermo Fisher公司；BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)P0018S)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑(產(chǎn)品編號(hào)15596- 026)、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(產(chǎn)品編號(hào)KR118)、Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)(產(chǎn)品編號(hào)FP209)，北京天根生化科技有限公司；淋巴細(xì)胞分離液Lymphoprep(產(chǎn)品編號(hào)AS1114547)，挪威Axis- shield公司；細(xì)胞因子GM- CSF(產(chǎn)品編號(hào)300- 03- 5)和IL- 4(產(chǎn)品編號(hào)200- 04- 20)，美國(guó)PeproTech公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cytoflex型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman公司；GeneQuant100型分光光度計(jì)，英國(guó)Biochrom公司；Cytation imaging reader型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；Roter Gene- Q型熒光定量PCR儀，德國(guó)Qiagen公司；ChemiScope6000EXPTouch型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 獻(xiàn)血者信息

30名獻(xiàn)血志愿者，平均年齡38.47±1.60歲，男女比例5∶1，所有志愿者都簽署了知情同意書(shū)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1免疫印跡法

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS- PAGE膠，15孔1.5 mm上樣梳。每孔上樣10 μL樣品，100 V電泳分離樣品中蛋白質(zhì)，之后通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)印跡至0.2 μm孔徑硝酸纖維素膜上。膜經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉水溶液封閉1 h之后，分別與phospho- NF- κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb、NF- κB p65 (L8F6) Mouse mAb、I- κB- α (L35A5) Mouse mAb、GAPDH(14C10) Antibody在4 ℃孵育過(guò)夜，之后用TBST buffer洗滌3次，每次10 min。再與相應(yīng)的二抗在室溫孵育1 h。膜經(jīng)TBST buffer洗滌3次，每次10 min之后，通過(guò)BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，其顯色圖像用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

HCT- 8細(xì)胞以30%～40%愈合度接種于6孔板中，總共8孔，其中6孔分別加入終質(zhì)量濃度10 mg/mL的不同益生元，待細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，加入感染復(fù)數(shù)MOI=100的EHEC(在加入前一天用LB培養(yǎng)基37 ℃搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，之后用分光光度計(jì)測(cè)量OD595 nm，按1 OD=1×108個(gè)/mL計(jì)算細(xì)菌濃度)刺激3 h，收取細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)基，用400 μL Trizol試劑重懸溶解。室溫放置10 min之后，加入等體積三氯甲烷混勻，12 000 r/min離心取上層水相，加入150 μL異丙醇混勻，12 000 r/min離心，棄上清液，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清洗一遍，再用20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解得總RNA(含總mRNA)。取4 μL總RNA與FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑配制成對(duì)應(yīng)體系，42 ℃孵育15 min，95 ℃滅活3 min得cDNA。用Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒及對(duì)應(yīng)引物在Roter Gene- Q熒光定量PCR儀上檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組樣品cDNA中TNF- α、IL- 6及GAPDH的擴(kuò)增曲線。根據(jù)擴(kuò)增曲線用Roter Gene- Q series software分析得到各曲線的循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold，ct)。以GAPDH為對(duì)照計(jì)算各組cDNA中的TNF- α及IL- 6的Δct，再以培養(yǎng)基對(duì)照組的TNF- α及IL- 6的Δct為基準(zhǔn)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組TNF- α及IL- 6的ΔΔct，最終各實(shí)驗(yàn)組的TNF- α及IL- 6的相對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平則由式(1)計(jì)算得到。

相對(duì)mRNA表達(dá)量=2-ΔΔct。

(1)

1.4.3益生元對(duì)HCT- 8細(xì)胞活性影響的測(cè)定

HCT- 8細(xì)胞以每孔2 000個(gè)的密度接種到96孔板中，同時(shí)分別加入對(duì)照培養(yǎng)基(NC組)或終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的不同益生元(GF2組、2′-FL組、FOS組、GOS組、MOS 組和Inulin組)，每組6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)孔。48 h之后加入MTT溶液至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入100 μL甲臜(formazan)溶解液，待紫色結(jié)晶全部溶解用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570 nm作為細(xì)胞活性指標(biāo)。最終各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)細(xì)胞活性值為各實(shí)驗(yàn)組與NC組的OD570 nm比值。

1.4.4EHEC誘導(dǎo)HCT- 8細(xì)胞炎癥響應(yīng)時(shí)間的測(cè)定

HCT- 8細(xì)胞以30%～40%愈合度接種于24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，加入感染復(fù)數(shù)MOI=100的EHEC刺激，之后分別在刺激的0、20、40、60、80、100 min時(shí)吸去培養(yǎng)基，并迅速加入1倍濃度的 sample loading buffer刮取細(xì)胞，細(xì)胞裂解液在100 ℃加熱10 min充分變性。最后通過(guò)免疫印跡法分析得到細(xì)胞裂解液中各蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.4.5益生元對(duì)HCT- 8細(xì)胞炎癥響應(yīng)影響的測(cè)定

HCT- 8細(xì)胞以30%～40%愈合度接種于24孔板的14個(gè)孔中，分為7組，分別加入對(duì)照培養(yǎng)基或終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的不同益生元，待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入感染復(fù)數(shù)MOI=100的EHEC刺激，之后每組的兩個(gè)孔分別在刺激的0 min和 40 min 時(shí)收取細(xì)胞裂解液樣品。最后通過(guò)免疫印跡法分析得到細(xì)胞裂解液中各蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.4.6樹(shù)突狀細(xì)胞的分離

無(wú)菌抽取人外周血，用PBS等體積稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液按說(shuō)明書(shū)步驟分離單個(gè)核細(xì)胞。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.84% NH4Cl水溶液裂解紅細(xì)胞10 min，離心，PBS清洗一遍后，細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL后，以每孔1 mL的量加入24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板37 ℃貼壁2 h，去除貼壁的單個(gè)核細(xì)胞，剩余細(xì)胞按2×106～5×106個(gè)/mL濃度每孔100 μL接種到96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.4.7益生元對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟影響的測(cè)定

加入新鮮配制的含有GM- CSF和IL- 4的細(xì)胞因子溶液至終質(zhì)量溶度為0.1 ng/mL，同時(shí)分別加入對(duì)照培養(yǎng)基或終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的不同益生元處理，細(xì)胞繼續(xù)在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。第3天進(jìn)行半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，收取樹(shù)突狀細(xì)胞。離心棄上清，每個(gè)96孔板的孔所有細(xì)胞用100 μL 1倍濃度的PBS重懸，加入1 μL Pacific BlueTManti-human CD11b Antibody及1 μL APC anti-human CD83 Antibody?；靹蚝笥谑覝乇芄夥跤?5 min。300 g離心5 min，棄上清。用200 μL 1倍濃度的PBS重懸，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面表型并分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

Western blot產(chǎn)生的灰度圖用ImageJ進(jìn)行灰度定量，所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5軟件雙邊配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；****代表P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生元對(duì)HCT- 8細(xì)胞活性的影響

在比較不同益生元的功效之前，需要確定一個(gè)使用濃度。由于母乳中低聚糖的總質(zhì)量濃度大約為10 mg/mL[15],因此本研究選用同一濃度10 mg/mL的不同益生元去處理腸上皮細(xì)胞，來(lái)比較不同益生元對(duì)于腸上皮細(xì)胞炎癥的影響。在此之前，檢測(cè)了該質(zhì)量濃度下各益生元對(duì)于細(xì)胞活性的影響，以確保接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在生理學(xué)上的意義。分別用不同益生元處理HCT- 8細(xì)胞48 h，然后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組細(xì)胞的相對(duì)活性，見(jiàn)圖1。

圖1 6種益生元對(duì)于HCT- 8細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of 6 kinds of prebiotics on cell viability of HCT- 8 cells

由圖1可知，10 mg/mL的6種益生元都不影響HCT- 8細(xì)胞的活性。

2.2 EHEC誘導(dǎo)HCT- 8細(xì)胞炎癥響應(yīng)時(shí)間曲線

為了比較不同益生元對(duì)于細(xì)胞炎癥的影響，本研究首先利用EHEC刺激HCT- 8細(xì)胞以建立細(xì)胞炎癥模型，并檢測(cè)炎癥激活的響應(yīng)時(shí)間曲線。HCT- 8細(xì)胞用EHEC刺激后，在不同的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞裂解液，免疫印跡檢測(cè)裂解液中炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白NF- κB p65的磷酸化情況，見(jiàn)圖2。

圖2 EHEC誘導(dǎo)的HCT- 8細(xì)胞中NF- κB炎癥信號(hào)通路激活時(shí)間曲線Fig.2 Time-course of EHEC-induced activation of NF- κB inflammatory signal pathway in HCT- 8 cells

由圖2可知，HCT- 8細(xì)胞在受到EHEC刺激后，NF- κB信號(hào)通路被激活，NF- κB p65蛋白的磷酸化水平(phospho-p65)迅速升高，在40 min左右達(dá)到峰值，之后出現(xiàn)下降，再升高。這與前期文獻(xiàn)報(bào)道的脂多糖LPS刺激下NF- κB信號(hào)通路激活曲線類似[16]。另外，本研究的結(jié)果顯示磷酸化的p65占總p65的比例也出現(xiàn)了同樣的變化趨勢(shì)。因此接下來(lái)本研究選取EHEC刺激40 min時(shí)的NF- κB信號(hào)通路激活水平來(lái)比較不同益生元對(duì)于EHEC誘導(dǎo)的NF- κB激活的影響。

2.3 益生元對(duì)HCT- 8細(xì)胞炎癥響應(yīng)的影響

用10 mg/mL質(zhì)量濃度的不同益生元預(yù)處理HCT- 8細(xì)胞48 h，再用EHEC刺激產(chǎn)生細(xì)胞炎癥，在刺激后的40 min收取細(xì)胞裂解液，分析其中NF- κB p65的磷酸化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

*,**,***分別代表P<0.05，P<0.01及P<0.001。圖3 6種益生元對(duì)于EHEC誘導(dǎo)的HCT- 8細(xì)胞NF- κB炎癥信號(hào)通路激活的影響Fig.3 Effect of 6 kinds of prebiotics on EHEC-induced activation of NF- κB inflammatory signal pathway in HCT- 8 cells

由圖3可知，EHEC刺激40 min時(shí)，無(wú)論對(duì)照組(NC)還是益生元處理組，磷酸化的p65(phospho-p65)的量及磷酸化的p65占總p65的比例(phospho-p65/p65)相比EHEC刺激前(0 min)都出現(xiàn)顯著的增加。但EHEC刺激40 min后，對(duì)照組與不同益生元處理組的p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例存在明顯的差異。與不加益生元處理的對(duì)照組相比較，加2′-FL或GOS的處理組p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例明顯偏低，且統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異，說(shuō)明2′-FL或GOS處理顯著降低EHEC誘導(dǎo)的NF- κB p65的磷酸化激活，即炎癥響應(yīng)。相同處理情況下，檢測(cè)NF- κB下游效應(yīng)因子TNF-α及IL- 6的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果也與NF- κB本身激活水平類似[見(jiàn)圖3(d)和圖3(e)]。GF2處理組的p65的磷酸化水平及磷酸化的p65占總p65的比例的平均值也比對(duì)照組低，且3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每一次結(jié)果(未顯示)也都比對(duì)照組低。只不過(guò)由于3次實(shí)驗(yàn)之間的誤差相對(duì)較大，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)不足以顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。另外，GF2處理組其下游效應(yīng)子TNF-α的mRNA表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組，因此可以說(shuō)GF2處理也降低EHEC誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥響應(yīng)。而FOS及MOS處理組則對(duì)于抑制EHEC引起的炎癥響應(yīng)并無(wú)一致性效果。

2.4 益生元對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響

為了測(cè)試不同聚糖類益生元對(duì)于人源樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響，本研究首先從志愿者的周環(huán)血中分離得到未成熟單核樹(shù)突狀細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)成熟分化的過(guò)程中加入不同的益生元，觀察其成熟情況。CD83分子與其配體的結(jié)合是樹(shù)突狀細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗原呈遞功能的基礎(chǔ)，而樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的最典型變化就是抗原呈遞能力的增強(qiáng)，因此CD83分子很早就被公認(rèn)為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的標(biāo)志物[17]。而最近的文獻(xiàn)又表明：CD11b分子通過(guò)與整合素分子的相互作用參與細(xì)胞遷移過(guò)程，在炎癥因子刺激的情況下，CD11b從細(xì)胞表面內(nèi)在化轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞往淋巴結(jié)遷移[18]。因此，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析樹(shù)突狀細(xì)胞表面CD11b及CD83分子的水平來(lái)監(jiān)測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，圖4(a)多邊形框中為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，相對(duì)于未成熟細(xì)胞其CD11b表達(dá)下降，CD83表達(dá)上升。紅色字體表示成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞占總樹(shù)突狀細(xì)胞的比例。本研究將益生元處理組的成熟比例除以對(duì)照組的成熟比例，得到益生元處理帶來(lái)的成熟比例變化倍數(shù)，然后取對(duì)數(shù)之后統(tǒng)計(jì)分析30個(gè)志愿者收集到的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示2′-FL(上升次數(shù)比例22/30)及Inulin(上升次數(shù)比例19/30)處理顯著增加樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟比例，而GOS(下降次數(shù)比例22/30)顯著降低樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟比例。GF2(上升次數(shù)比例8/14)及MOS(上升次數(shù)比例18/30)處理也促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，但統(tǒng)計(jì)未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。FOS(上升次數(shù)比例14/30)處理則對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞成熟沒(méi)有一致性影響。

3 結(jié) 論

免疫調(diào)節(jié)是益生元應(yīng)用的重要方向，而應(yīng)用益生元輔助治療炎癥性腸病則是免疫調(diào)節(jié)方向的一個(gè)典型運(yùn)用[19]。腸上皮細(xì)胞在炎癥因子刺激下的過(guò)度炎癥響應(yīng)是造成炎癥性腸病的關(guān)鍵因素[14]。之前有研究報(bào)道指出2′-FL可以明顯地降低脂多糖LPS引起的HCT- 8腸上皮細(xì)胞炎癥響應(yīng)[8]，且其他多項(xiàng)已經(jīng)報(bào)道的工作也提出2′-FL可以抑制TLR4/NF- κB炎癥信號(hào)通路[11-12, 20-21]?？紤]到LPS被認(rèn)為是EHEC上刺激細(xì)胞炎癥響應(yīng)的主要因子之一[22]，本研究結(jié)果與之前報(bào)道相符。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)GOS以及GF2也可以直接抑制EHEC引起的腸上皮細(xì)胞炎癥響應(yīng)，目前還沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道類似結(jié)果。FOS中含有很大比例的GF2(約50%)，但卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，可能是FOS中其他非GF2組分不具有抑制炎癥效果或者反而干擾GF2的抑制炎癥效果，暗示益生元組分的純度可能對(duì)于其發(fā)揮功能至關(guān)重要。

樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟可以顯著的增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力，因此對(duì)于機(jī)體盡快啟動(dòng)特異性免疫清除外源炎癥刺激因子起到很重要的作用[23]。之前有文獻(xiàn)提出2′-FL處理并不能直接影響人樹(shù)突狀細(xì)胞成熟[24]，但本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)2′-FL處理可以顯著促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。這其中的差異可能是由于文獻(xiàn)中處理細(xì)胞時(shí)使用的2′-FL濃度不夠，本研究使用的質(zhì)量濃度(5 mg/mL)要高于文獻(xiàn)所用質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL)，這也提示了益生元使用劑量的重要性。之前有文獻(xiàn)表明2′-FL可以直接結(jié)合樹(shù)突狀細(xì)胞表面受體蛋白DC- SIGN(dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)[25]，而DC- SIGN受體可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)ERK1/2-NF- κB等信號(hào)通路促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及細(xì)胞因子分泌[26]，2′-FL是否通過(guò)與DC- SIGN結(jié)合從而激活NF- κB信號(hào)通路促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，本研究的研究發(fā)現(xiàn)Inulin雖然對(duì)于EHEC引起的腸上皮細(xì)胞炎癥沒(méi)有明顯的調(diào)節(jié)作用，但卻可以顯著地促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。GOS可以明顯地抑制EHEC引起的腸上皮細(xì)胞炎癥，但同時(shí)也會(huì)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。FOS雖然含有大比例的GF2，但似乎FOS中除了GF2以外的其他組分發(fā)揮著與GF2相反的效果，導(dǎo)致FOS總體上對(duì)于腸上皮細(xì)胞炎癥及樹(shù)突狀細(xì)胞成熟都無(wú)明顯效果，提示提升FOS中GF2含量的必要性。雖然GOS、Inulin及GF2都能影響樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，但具體分子機(jī)制如何還需進(jìn)一步研究。據(jù)筆者所知，目前還沒(méi)有與它們結(jié)合的受體及它們直接調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，可能是由于糖類化合物的相互作用蛋白不容易鑒定。不過(guò)隨著相關(guān)糖蛋白組學(xué)技術(shù)[27-29]的發(fā)展，相信未來(lái)各種糖類益生元的直接細(xì)胞生物學(xué)功能機(jī)制也將逐漸被揭露出來(lái)?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究的結(jié)果說(shuō)明不同的益生元其對(duì)宿主的生理作用都具有其特異性，還有很多種的益生元以及更多相關(guān)的生物學(xué)功能有待被研究，這樣的研究將有助于了解清楚不同益生元細(xì)致的作用機(jī)制，促進(jìn)益生元的精準(zhǔn)化應(yīng)用。