4種自粘接樹脂水門汀對牙周膜成纖維細胞增殖的影響

羅嵐， 盧巧喬， 陳成新， 鄭馨回， 劉世震， 趙偉,3

自粘接樹脂水門汀(self-adhesive cement)由于其良好的粘接性能、簡便的操作及較低的牙本質術后敏感，在臨床上多用于各種修復體的粘接。若粘接劑殘留，游離單體等成分在粘接劑固化后可能會有不同程度析出，從而對牙周組織產生影響。此外，冠粘接后的樹脂水門汀殘留可能是導致冠邊緣或種植體周緣牙槽骨吸收、牙齦退縮等的原因[1]。人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts, HPDLFs)具有多向分化能力，在外界刺激狀態(tài)下，參與牙周膜、牙骨質和牙槽骨重塑，是牙周組織愈合和再生的重要基礎[2]。粘接劑的殘留及析出物與牙周組織密切接觸，HPDLFs的狀態(tài)與牙周健康息息相關。為比較不同自粘接樹脂水門汀對牙周組織的影響，本研究比較臨床上常用的4種自粘接樹脂水門汀(RelyX Unicem、SAC、Duo-Link和PermaCem)的浸提液對HPDLFs增殖的影響，以期為臨床上選擇理想的粘接材料以及使用方法提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙齒 選取2017—2018年因正畸需要拔除的無齲病、無牙周病的前磨牙15顆，男性8顆，女性7顆，患者年齡10～20歲。本研究經醫(yī)院倫理委員會同意，受試者均知情同意。

1.1.2 主要試劑和儀器 RelyX Unicem自粘接樹脂水門汀(ESPE，美國3M公司)；SAC可樂麗菲露復合樹脂粘接劑(日本可樂麗醫(yī)療器材株式會社)；Duo-Link樹脂水門汀(美國BISCO公司)；PermaCem 2.0自粘接樹脂水門汀(德國DMG公司)；DMEM低糖培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；優(yōu)級南美胎牛血清(加拿大Wisent公司)；胰酶(美國Gibco公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)粉劑(北京蘭杰柯科技有限公司)；青霉素-鏈霉素混合液(上海碧云天生物技術研究所)。CCK-8細胞計數試劑盒(CK04，日本同仁化學研究所)；CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱(3111，美國Thermo公司)；熒光相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(DMIL/DFC295，德國萊卡公司)；生物安全超凈臺(上海力申科學儀器有限公司)；酶聯免疫檢測儀(ELX808，美國Bio-Tek公司)；自動細胞計數儀(美國Countstar公司)；LED 光固化燈(EliparTMS10，美國3M公司)。其他普通試劑和常用儀器由福建省高?？谇会t(yī)學重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 試件制備 利用聚甲基丙烯酸甲酯模具制作硅橡膠方塊(20 mm×8 mm×10 mm)，共16個，每個方塊里有3個高8.0 mm、內徑4.0 mm的圓柱體凹槽，將Unicem、SAC、Duo-Link和PermaCem等4種粘接劑按說明書混合調拌，緩慢注入硅橡膠凹槽內，將硅橡膠置于固定框架內，蓋上聚甲基丙烯酸甲酯蓋板，用光固化燈(400～490 nm)沿各個方向分別照射粘接劑40 s，待粘接劑固化后,用無菌鑷子取出試件，經紫外線照射消毒90 min后備用。

1.2.2 浸提液制備 按照DMEM完全培養(yǎng)液體積與試件表面積之比為1.885 mL/cm2的標準[3]。將每個品牌的試件分成4組，每組含3個試件。將試件放入15 mL的離心管中，加入2 mL的DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫箱中。分別于浸泡1、3、5 和7 d時取浸提液，用0.22 μm濾菌器過濾，得到無菌的樹脂浸出液。

1.2.3 HPDLFs的原代培養(yǎng)與鑒定 采用酶消化組織塊法[4]，將牙齒移入裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，保持牙面濕潤，用PBS沖洗牙齒3～4次，除去血污。用無菌刀片刮取根中1/3部位的牙周膜，直接移入1 mL含0.05% Ⅰ型膠原酶的PBS中，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。每10 min振蕩1次，共消化20 min，1 000 r/min 離心5 min，去除上清液。加入DMEM完全培養(yǎng)液1 mL，吹勻，接種于6孔板，繼續(xù)添加DMEM至3 mL。待細胞長出后，每3天換液1次，待組織塊中游出的細胞鋪滿孔底的80%時，胰酶消化傳代。在顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮變圓后，終止消化，換液后完成傳代。為盡可能保持原始異質性并盡量減少克隆細胞，HPDLFs不應在后期傳代(不超過7代)使用[5]。取3～5代的細胞用于實驗。

取生長狀態(tài)良好的第3代HPDLFs，0.25%胰酶消化后，制備細胞爬片。待細胞長至孔板的70%時，丙酮固定，常規(guī)免疫組織化學法進行波形絲蛋白、角蛋白單抗染色，光鏡下觀察。

1.2.4 CCK-8實驗 取生長良好的第5代對數生長期的HPDLFs，用0.25%胰酶消化，調整細胞密度至1×105mL-1[6]，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細胞，每個板分別加入相同浸提時間的4種樹脂浸提液100 μL，每種品牌重復5個孔，同時設置陰性對照組。標準環(huán)境下孵育48 h后，吸去樹脂浸提液，用無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗2次后，每孔內加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯檢測儀下測定光密度(optical density, OD)值，用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)并拍照。計算各實驗組細胞的相對增殖率(relative growth rate, RGR)。根據RGR[7]將細胞毒性分為0～5級，共6級。

RGR=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件分析4種自粘接樹脂水門汀浸提液培養(yǎng)HPDLFs的OD值，采用重復測量資料的方差分析，多重比較采用LSD法對數據進行分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 形態(tài)學觀察 HPDLFs呈長梭形或星形，胞突細長，胞體較大，胞質均勻，核呈圓形或卵圓形，分布均勻(圖1)，約20 d長滿。

圖1 牙周膜成纖維細胞的形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of periodontal ligament fibroblasts

2.2 免疫組織化學鑒定 波形絲蛋白經染色胞質呈現出棕黃色，呈陽性(圖2A)；角蛋白胞質無染色，呈陰性(圖2B)。結果表明，實驗所獲得的細胞來源于中胚層，屬于纖維細胞，且未出現上皮源性細胞污染情況。

2.3 各實驗組OD值、細胞RGR和細胞毒性分級 各實驗組OD值、細胞RGR見表1。4種自粘接樹脂水門汀均是3 d浸提液的細胞RGR達到最低，隨浸提時間延長，RGR增加(圖3)。細胞毒性分級結果顯示，4種自粘接樹脂水門汀1 d浸提液的毒性分級均為0級；浸提3 d時，Unicem組毒性分級為3級，SAC組和Duo-Link組為2級，PermaCem組為1級；浸提5 d時，除了SAC組毒性分級為2級，其余3組對細胞均無毒性；浸提7 d時，4種樹脂水門汀均無細毒性。結合細胞形態(tài)進行綜合分析(圖4)，浸提3 d的Unicem組、SAC組和Duo-Link組以及浸提5 d的SAC組，各組細胞密度均勻，貼壁伸展，形態(tài)正常呈梭形或星形，浸提3 d的Unicem組和SAC組細胞密度略低于對照組。可見浸提3 d的Unicem組、SAC組和Duo-Link組以及浸提5 d的SAC組對HPDLFs的細胞毒性較小，對細胞增殖影響較小。

A：波形絲蛋白染色呈陽性；B：角蛋白染色呈陰性。圖2 牙周膜成纖維細胞免疫組織化學結果Fig.2 Immunohistochemical results of HPDLFs

RGR：相對增殖率。圖3 各實驗組細胞RGR折線圖Fig.3 Line chart of relative growth rate of cells in each experimental group

表1 各實驗組及陰性組OD值、RGR和細胞毒性分級

2.4 同一時間不同浸提液對細胞增殖的影響 浸提1 d，Unicem組的細胞RGR最高，顯著高于SAC組、PermaCem組和陰性對照組(P<0.05)，其余各組組間比較差別均無統(tǒng)計學意義(圖5A)。浸提3 d，Unicem組、SAC組和Duo-Link組的細胞RGR顯著低于陰性對照組(P<0.05)，其中Unicem組最低(圖5B)。浸提5 d，所有實驗組的細胞RGR均顯著低于陰性對照組(P<0.05，圖5C)。浸提7 d，各組間差別均無統(tǒng)計學意義(圖5D)。

2.5 同一浸提液在不同時間下對細胞作用的影響 Unicem組3 d浸提液的RGR最低，顯著低于1和7 d(P<0.05)；5 d的RGR較低，顯著低于1 d(P<0.05，圖6A)。SAC組1 d浸提液的RGR最高，3、5、7 d均顯著低于1 d(P<0.05)，而3、5、7 d之間兩兩比較，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖6B)。Duo-Link組浸提3和5 d的RGR均顯著低于1 d(P<0.05，圖6C)。PermaCem組浸提3和5 d的RGR均顯著低于1 d (P<0.05，圖6D)。

3 討 論

臨床上，即使再精密的修復體，如果粘接材料發(fā)生了體積收縮或溶解，冠邊緣就會發(fā)生微滲漏，使得粘接劑暴露于口腔環(huán)境。AUGSTI等[8]發(fā)現，在體外對氧化鋯進行清潔，無論使用何種類型粘接劑，在所有氧化鋯的冠邊緣，特別是在鄰接區(qū)附近，仍然發(fā)現了粘接劑殘留。而不同的樹脂水門汀在固化以及口腔唾液的作用下，會有不同的成分(如游離單體及金屬離子等)析出[9]，從而對牙周組織產生影響。

A：浸提3 d的Unicem組；B：浸提3 d的SAC組；C：浸提3 d的Duo-Link組；D：浸提5 d的SAC組；E：浸提7 d的Unicem組；F：浸提7 d的SAC組。圖4 浸提3、5和7 d的實驗組細胞形態(tài)學觀察Fig.4 Morphological observation of cells in the experimental group after 3, 5 and 7 days of leaching

RGR：相對增殖率。A：1 d；B：3 d；C：5 d；D：7 d。圖5 不同時間浸提液處理后各實驗組和對照組的細胞RGR比較Fig.5 Comparison of RGR between the experimental groups and the control group after treatment with the extract at different times

RGR：相對增殖率。A：Unicem；B：SAC；C：Duo-Link；D：PermaCem。圖6 4種自粘接樹脂水門汀浸提不同時間的細胞RGR比較Fig.6 Comparison of RGR of cells extracted with four kinds of self-adhesive resin cements at different times

細胞毒性試驗為評估材料生物相容性的初步篩選試驗，其中CCK-8法具有方便、靈敏、重復性高及細胞毒性小等優(yōu)點。以往大多數細胞毒性的體外研究主要集中在對小鼠或人類牙髓細胞或牙齦成纖維細胞等的影響。然而，牙周組織相關細胞與粘接劑的接觸更密切。因此，本研究選用的是HPDLFs，其在牙周膜中膠原的更新與重建及牙周組織的修復和再生中起重要作用[10]，參與鄰近牙槽骨和牙骨質的改建及修復再生[11]。盡管細胞系可能有助于在不同研究中建立更統(tǒng)一的結果，但使用原代培養(yǎng)物進行研究更接近臨床實際情況。在早期傳代中使用的原代HPDLFs細胞具有保持原始組織特征的表型和功能異質性的優(yōu)勢，能更好地模擬HPDLFs的情況[5]。

自粘接樹脂水門汀因其將酸性成分和偶聯劑混合一起，無需對牙面做任何特殊處理，也無需使用粘接劑，即可在牙體和修復體之間形成良好的化學粘接，臨床操作簡便，粘接強度穩(wěn)定、美觀，得到廣大口腔臨床醫(yī)生的喜愛，臨床應用廣泛。自粘接樹脂水門汀結合了光固化粘接劑和化學固化粘接劑的部分特點，雙固化的優(yōu)點是允許粘接劑在光照不能到達的深層區(qū)域進一步進行化學固化[12]。因此，本研究選用了4種臨床上常見的自粘接樹脂水門汀，并比較了它們對HPDLFs增殖的影響，以期為臨床醫(yī)生選擇合適的粘接材料提供一定的思路。

樹脂水門汀在細胞培養(yǎng)中表現出毒性反應，主要是由材料釋放的單體引發(fā)。本實驗結果表明，第1天 4種材料均無毒性，第3天出現細胞抑制，第7天無細胞毒性。KAWAHARA等[13]使用高效液相色譜法檢測固化樹脂的殘留單體釋放時間，發(fā)現超過50%的單體在3 h內從固化樹脂中洗脫出來，殘留單體逐漸浸出長達3 d，隨后保持不變，鄰苯二甲酸酯的釋放在7 d后保持不變。自粘接樹脂水門汀比傳統(tǒng)樹脂具有更高的吸水性和溶解性[14]。為了實現與空間的黏合，自粘接樹脂水門汀含有高濃度的酸性單體，過高的酸度增加了這些單體的親水性，增強了它們的浸出能力[15]。因此第1天4種自粘接樹脂水門汀未出現對細胞的抑制，可能與在無隔離屏障下進行較為充分的光固化以及浸提液中釋放的單體量較少有關。而第3天出現明顯的細胞抑制，可能與單體釋放3 d的毒性累積效應有關。

FRASHERI等[16]對自粘接樹脂水門汀和常規(guī)樹脂與牙周膜細胞直接共培養(yǎng)的細胞毒性比較發(fā)現，培養(yǎng)至第21天仍有較強的細胞毒性(Panavia >Smart Cem >RelyX Unicem> Variolink，P<0.000 1)。牙周膜細胞通常不會與修復體邊緣直接接觸，主要受齦溝液的間接影響。因此，本研究采用自粘接樹脂水門汀的浸提液進行檢測。NOCCA等[17]發(fā)現，在無隔離屏障的情況下，從固化的自粘接樹脂水門汀中釋放的單體量明顯低于在有陶瓷或復合屏障的情況下釋放的單體量。文獻[13]的結果顯示，Unicem、Multilink Speed自粘接樹脂水門汀在第2天表現出最大的細胞毒性，常規(guī)樹脂則表現為刺激后即刻的細胞毒性，且在第7天達到最低水平。OGUZ等[18]的研究得到了相似的結果，他們檢測了兩種傳統(tǒng)的雙聚合(RelyX ARC和VariolinkN)和兩種自粘接(RelyX Unicem和Multilink Speed)樣品水門汀的細胞毒性，在第7天達到最低水平，殘留單體釋放在7 d內完成[2]。本研究發(fā)現，浸泡7 d的4種自粘接樹脂水門汀均無細胞毒性，且細胞貼壁生長，形態(tài)未見明顯異常，結果與上述文獻一致。

最近，一項有關牙齦成纖維細胞毒性的研究發(fā)現，固化類型不是細胞毒性的決定因素，更重要的是材料的組成[19]。筆者對4種水門汀的主要成分進行分析，發(fā)現Unicem組、SAC組和PermaCem組單體的主要成分中均含有雙酚a-甲基丙烯酸縮水甘油酯(BisGMA)，Duo-link組的主要單體為三甘醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)。在主要單體中，尤其是BisGMA和二甲基丙烯酸氨基乙酯(UDMA)比TEGDMA和甲基丙烯酸2-羥乙基酯(HEMA)具有更強的細胞毒性[18]。本實驗結果表明，浸提3 d時，Unicem組、SAC組和Duo-Link組表現為輕中度細胞毒性，鏡下觀察，Unicem組和SAC組的細胞數量相對較少，細胞形態(tài)貼壁生長，未見明顯變化。本實驗第7天時，受試的樹脂水門汀均無細胞毒性。因此認為4種自粘接樹脂水門汀都是良好的可供選擇的粘接劑，相比較下，PermaCem的生物相容性更好些。

本實驗作為目前臨床常用自粘接樹脂水門汀材料毒性的初探，應考慮體外研究的局限性。第一，光聚合在降低細胞毒性作用中起重要作用，在存在陶瓷屏障的情況下，雙固化樹脂水門汀會釋放出更多的單體，當使用厚度不超過2 mm的陶瓷或樹脂納米陶瓷修復體時，被測材料的細胞毒性水平并不顯著[20]。而本實驗自粘接樹脂水門汀采用無屏障作用下體外光固化，并不能很好地模擬臨床上存在屏障的情況下的固化。因此，臨床實際雙固化的轉化率情況還與屏障物的材料厚度和醫(yī)師的操作有關。第二，口內的環(huán)境復雜，細胞種類繁多，而本實驗研究的是HPDLFs單一的細胞群，存在一定的局限性。有研究者將12種不同的樹脂粘接劑制成的盤狀標本，通過Transwell細胞培養(yǎng)系統(tǒng)直接刺激5種不同的人類細胞系，所有測試的粘接劑均導致細胞活力下降，但在一定程度上取決于細胞類型，其中在成骨細胞系中檢測到最高的細胞毒性作用[21]。第三，粘接劑殘留在口腔內是個長期的過程，本實驗設定的觀察時間為7 d，長期的生物效應尚未確定。

目前，臨床上可供選擇的粘接劑較多，如何選擇更可靠、更便捷的產品是臨床醫(yī)生普遍關心的問題。口腔材料日新月異，自粘接樹脂水門汀也在不斷改進升級中，使得牙科粘接樹脂的自我修復成為可能。胡格等[22]在自粘接樹脂水門汀中加入納米抗菌無機填料，以提高材料的抗菌及自我修復功能。臨床醫(yī)師也應該按照雙固化操作流程提高樹脂水門汀固化轉化率，減少游離單體溢出，去除粘接劑，減少粘接劑殘留，有利于修復體、種植體及牙周組織健康。