超聲波-復合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝優(yōu)化*

宋 娜，李竹生，張艷麗

（鄭州職業(yè)技術(shù)學院 生物標志物定量檢測河南省工程實驗室，鄭州 450121）

低聚木糖亦稱木寡糖（xylooligosaccharide，簡稱XOS)，由2～7個D-木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的功能性聚合糖[1]。低聚木糖具有優(yōu)異生物學特性[2]，如增殖雙歧桿菌的能力，不被消化、預防齲齒，促進人體鈣吸收等，被廣泛地應用于食品、藥品和化妝品等工業(yè)中。

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，以玉米秸稈為代表的農(nóng)林生物質(zhì)原料來源廣泛、價格低廉，在很多方面有著巨大的潛在利用價值，玉米秸稈高值化利用是近幾年來的熱門話題[3]。以農(nóng)林生物質(zhì)材料制備新型功能性聚合糖——低聚木糖逐漸成為研究者的研究熱點。關(guān)海寧等[4]通過響應面法對微波預處理輔助木聚糖酶制備稻殼低聚木糖的工藝進行了優(yōu)化；孫軍濤等[5]通過單因素和正交試驗確定了超聲波輔助復合酶法制備玉米芯低聚木聚糖的最佳工藝。玉米秸稈中半纖維素含量較高，且為木聚糖類半纖維素，是制備低聚木糖的理想原料，超聲波在酶催化水解過程中具有協(xié)同作用[6]。本試驗采用超聲波處理玉米秸稈，用木聚糖酶和纖維素酶組成的復合酶對超聲波處理后的玉米秸稈液進行酶解制備低聚木糖，該方法反應條件溫和可控、安全、無污染，創(chuàng)新了以玉米秸稈為原料制備低聚木糖技術(shù)，提高了玉米秸稈附加值利用，對保護環(huán)境，維護生態(tài)平衡有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料：玉米秸稈收集于鄭州市滎陽郊區(qū)，除去稈皮，粉碎過60目篩，用水洗凈，于45℃鼓風干燥箱中烘干，裝密封袋備用。

1.2 主要試劑

木聚糖酶和纖維素酶，上海源葉生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，天津市大茂化學試劑廠；乙腈，色譜級，天津市大茂化學試劑廠；木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖的分析標準品，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗儀器設(shè)備

HH-US型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇新春蘭科學儀器有限公司；ES-J型分析天平，廈門萊斯德科學儀器有限公司；UV-8000型紫外分光光度計，上海精密儀器儀表公司；TGL-16型離心機，長沙湘儀試驗儀器有限公司；XO-1800D超聲波細胞粉碎機，南京先歐儀器制造有限公司：LC981-AAA型高效液相色譜儀，上海五豐科學儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1超聲波-復合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝方法

1.4.1.1超聲處理玉米秸稈提取木聚糖

考察不同超聲波溫度和超聲處理時間對木聚糖提取率的影響。稱取20.00 g玉米秸稈放入燒杯，加入400 mL去離子水后進行超聲波處理。

1.4.1.2復合酶水解制備低聚木糖

用NaOH溶液調(diào)節(jié)超聲處理后玉米秸稈液pH值至5.8，添加一定量配比的復合酶，在50℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中酶解。酶解結(jié)束后，將酶解液置于沸水浴煮沸10 min滅酶活性。取上清液測定還原糖含量、可溶性總糖含量和平均聚合度。

1.5 試驗分析方法

1.5.1還原糖含量測定：DNS法[7]；

1.5.2可溶性總糖測定

向酶解后的玉米秸稈渣液中加入質(zhì)量濃度為72.00 g/L的濃硫酸，沸水浴2 h，冷卻后，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，用DNS法測定可溶性總糖的含量。

1.5.3平均聚合度（DP）的計算

DP=可溶性總糖含量/還原糖含量

1.5.4單因素試驗

分別選擇超聲波溫度、超聲處理時間、木聚糖酶和纖維素酶配比、復合酶添加量和酶解時間作為影響因素，以酶解液中還原糖含量、可溶性總糖含量及平均聚合度為指標，研究各因素對制備玉米秸稈低聚木糖的影響。

1.5.5超聲波-酶法制備玉米秸稈低聚木糖優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法（Box-Behnken）試驗設(shè)計原理，以超聲波溫度、超聲處理時間、復合酶添加量、酶解時間為影響因素，以酶解液中還原糖含量為響應值，設(shè)計4因素3水平的響應面優(yōu)化試驗方案。

1.6 低聚木糖高效液相色譜法（HPLC）分析

色 譜 柱：ShimNex S-NH2-SOG，3.5 μm，4.6×250mm；流動相：乙腈：水65：35；流速：10 mL/min；進樣量10 μL；柱溫：80℃；樣品濃度：20 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1超聲波溫度對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

分別設(shè)定超聲波溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件下，超聲處理玉米秸稈60 min，添加2.0%（相對于玉米秸稈干物料，下同）的復合酶（木聚糖酶和纖維素酶按1∶1配比）酶解3 h，考察超聲波溫度對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖1所示：隨著超聲波溫度的升高，還原糖含量和可溶性總糖含量先逐漸升高后有些許降低，平均聚合度隨溫度升高逐漸降低。當超聲波溫度達到50℃時，還原糖含量和可溶性總糖含量達到最大，分別為36.87mg/g和75.29 mg/g，此時平均聚合度為2.04。這是因為玉米秸稈中半纖維素是以氫鍵和范德華力與木質(zhì)素緊密連接，使得植物細胞之間具有一定的抗降解能力，阻止了結(jié)構(gòu)多糖的酶解聚合，超聲波主要通過空化效應與機械效應作用于玉米秸稈，超聲溫度越高，產(chǎn)生的超聲波空化效應越劇烈，對玉米秸稈細胞壁的破碎能力越強，利于糖組分的溶出。但隨著超聲波溫度的繼續(xù)升高，破壞糖的結(jié)構(gòu)，使還原糖糖含量和可溶性總糖含量下降。故超聲波溫度選擇50℃。

圖1 超聲波溫度對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.2超聲波處理時間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

設(shè)定超聲波溫度50℃，分別超聲處理玉米秸稈20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，添加2.0%復合酶（木聚糖酶和和纖維素酶酶按1∶1配比）酶解3h，考察超聲處理時間對低聚木糖制備的影響，結(jié)果如圖2所示：隨著超聲處理時間的延長，還原糖含量和可溶性總糖含量先升高后逐漸降低，平均聚合度逐漸降低；當超聲超過處理時間達到40 min時，還原糖含量和可溶性總糖含量最高，分別為：35.93 mg/g和73.86 mg/g，此時平均聚合度為2.06。這是因為剛開始超聲處理時超聲波產(chǎn)生的空化效應、機械效應促進玉米秸稈結(jié)構(gòu)的破壞，加速糖的溶出；但隨著超聲處理時間的延長，部分溶出的糖降解為糠醛，導致酶解液中還原糖含量和可溶性總糖含量降低。因此，選擇超聲處理時間為40 min。

圖2 超聲波處理時間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.3復合酶配比對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

設(shè)定超聲波溫度50℃處理玉米秸稈40 min，添加2.0%復合酶（木聚糖酶和纖維素酶分別按3∶1、2∶1、1∶1、1∶2配比）酶解3 h，考察復合酶配比對低聚木糖制備的影響，結(jié)果如圖3所示：當木聚糖酶與纖維素酶配比為2∶1時，酶解液中還原糖含量最大，達到34.76 mg/g，可溶性總糖含量為49.91 mg/g，平均聚合度為2.08。這是因為木聚糖通過木聚糖酶、纖維素酶等進行水解，由于木聚糖酶具有優(yōu)異的定向水解能力，能夠隨著酶解反應的深入，破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，使更多低聚木糖溶出。當纖維素酶占的比例大時，纖維素酶充分降解了植物細胞壁的纖維素骨架，使木聚糖很容易從細胞壁中溶出，溶出的總糖量增加，因為木聚糖與酶蛋白間反應位點空間有限，當木聚糖酶過量時這些活性位點將會全部被木聚糖酶占據(jù)，而多余的酶只會與底物形成無效吸附，反而使酶解率降低、成本增加；而木聚糖酶占的比例較低時，沒有足夠的木聚糖酶降解木聚糖，使還原糖的量降低。綜合還原糖、可溶性總糖量以及平均聚合度指標，復合酶的配比選擇2∶1。

圖3 復合酶配比對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.4復合酶添加量對玉米秸稈低聚木糖制備影響

選擇溫度為50℃超聲處理玉米秸稈40 min，分別添加0.25%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%的復合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1）酶解3 h，考察復合酶添加量對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖4所示：還原糖含量和可溶性總糖含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當復合酶的添加量從0.50%增加至1.00%時，可溶性總糖的含量和平均聚合度逐漸增加，并在復合酶添加量為1.00%時還原糖含量和可溶性總糖達到最高，分別為34.87 mg/g和68.25mg/g。此時平均聚合度為1.96。平均聚合度隨著復合酶添加量的增大逐漸減小。這是因為當復合酶添加量小于1.00%時，酶解反應體系中底物木聚糖過量，反應速率的增加隨著復合酶的增加而增大。隨著復合酶添加量進一步增加，還原糖的產(chǎn)量略有下降。這可能是由于反應體系中自由水的量減少，混合效率低下，導致物質(zhì)間的傳質(zhì)效能降低，進而限制了木聚糖水解進程。因此，選擇復合酶的添加量為1.00%。

圖4 復合酶添加量對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.5酶解時間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

在超聲波溫度50℃條件下處理玉米秸稈40min，添加1.0%的復合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1），分別酶解10 min、20min、30 min、40 min、50 min，考察復合酶酶解時間對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖5所示：還原糖含量和可溶性總糖含量均呈現(xiàn)先升高后有些許下降，平均聚合度逐漸降低。當酶解30 min時，酶解液中還原糖含量和可溶性總糖達到最高，分別為35.37 mg/g和68.49 mg/g。此時平均聚合度為1.94。在酶解反應初期，木聚糖酶與木聚糖粗液充分接觸，使得還原糖和總糖產(chǎn)量迅速上升，隨著木聚糖粗液消耗量不斷加大，反應趨于相對飽和的狀態(tài)，最后還原糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)平穩(wěn)的狀態(tài)。考慮到酶反應的高效性以及酶的活性會隨時間的延長會逐漸降低，還原糖含量增加不明顯，反應時間過長會增加能耗。綜合還原糖、可溶性總糖量以及平均聚合度指標，選擇酶解時間為30 min。

圖5 酶解時間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.2 采用響應面分析法對超聲波-酶法制備玉米秸稈低聚木糖的工藝的優(yōu)化

綜合2.1單因素試驗結(jié)果，運用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以還原糖含量為響應值，設(shè)計4因素3水平的響應面優(yōu)化試驗方案。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面因素設(shè)計水平

2.2.1響應面分析方案及結(jié)果

由Design-Expert軟件做響應面優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面分析方案及結(jié)果

2.2.2方差分析

利用Design-Expert軟件對所得結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表3。

從表3可知：模型P＜0.000 1，說明該模型高度顯著，失擬項P=0.152 4（＞0.05），說明失擬項不顯著。說明模型擬合良好，試驗誤差小，可以通過此模型來預測玉米秸稈低聚木糖制備的最優(yōu)條件。一次項(A、C、D)、交互項A和C、二次項（A2、D2）對結(jié)果影響顯著(P≤0.05)，說明因素超聲波溫度，復合酶添加量和酶解時間對還原糖含量的影響線性關(guān)系顯著，超聲波溫度和復合酶添加量交互作用對低聚木糖制備影響顯著。

2.2.3響應曲面圖分析

通過Design Expert 10.0.7軟件分別做出超聲波溫度和復合酶添加量交互作用的響應曲面，結(jié)果如圖6所示：超聲波溫度和復合酶添加量對水解液中還原糖含量的影響顯著，還原糖含量的變化均是隨兩者的增大而增大。隨著超聲波溫度的升高，復合酶添加量減小，表現(xiàn)為曲線較陡，曲面圖越陡表示交互作用強。超聲波溫度和復合酶添加量之間的交互作用對玉米秸稈制備低聚木糖的影響與表3中的方差分析結(jié)果一致。

圖6 超聲波溫度和復合酶添加量的交互作用對低聚木糖制備結(jié)果影響的響應面圖

表3 回歸模型方差分析表

2.2.4最佳提取條件的驗證

通過Design Expert 10.0.7軟件預測最佳制備玉米秸稈低聚木糖的條件：超聲波溫度56.38℃，超聲處理時間42.89 min，復合酶添加量0.806%，酶解時間28.17 min，酶解液中還原糖含量36.24 mg/g。為了驗證預測條件與實際工藝的符合性，做驗證試驗，結(jié)合實際情況，選擇超聲波溫度56℃，超聲處理時間40 min，復合酶添加量0.80%，酶解時間30 min，做3次平行驗證，酶解液中還原糖含量實際平均值為36.43 mg/g，與理論預測值基本一致。此時，可溶性總糖含量為74.32 mg/g,平均聚合度為2.04。表明該模型可較好地擬合玉米秸稈低聚木糖制備過程。

2.2.5HPLC成分分析

從低聚木糖的HPLC分析圖可以看出：制備的低聚木糖產(chǎn)物除少量木糖外，主要是木二糖和木三糖。木二糖和木三糖在酶解產(chǎn)物中占比82.7%。低聚木糖組成不同，功能不同，作為益生元的一種，低聚木糖的活性組分以木二糖、木三糖和木四糖為優(yōu)，可改善腸道微生態(tài)，調(diào)節(jié)人體生理機能，促進機體對鈣、鐵等礦物質(zhì)吸收[8]。用此方法制備的低聚木糖可很好滿足低聚木糖作為益生元的活性組分的需求。

圖7 低聚木糖的HPLC分析圖

3 結(jié)論與討論

應用響應面分析法優(yōu)化超聲波-復合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝，得出最佳工藝條件為：超聲波溫度56℃，超聲處理時間40 min，復合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1）添加量0.8%，酶解時間30 mim，酶解液中還原糖含量為36.43 mg/g，可溶性總糖含量為74.32 mg/g,平均聚合度為2.04。HPLC分析顯示：制備的低聚木糖的主要成分為木二糖和木三糖。該研究結(jié)果可為超聲波-復合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝提供一定的參考依據(jù)。