苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病菌的聯(lián)合毒力及防效

李建明，何 蓮，孔玄慶，喻 快，成淑芬，吳曉峰，歐曉明*

（1.湖南化工研究院國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程研究中心/湖南省農(nóng)用化學(xué)品重點實驗室，長沙 410014；2.湖南化研院檢測技術(shù)有限公司，長沙 410014；3.湖南永州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南永州 425100）

柑橘是世界第一大果樹品種，其種植面積和產(chǎn)量均居果樹首位，炭疽病是柑橘的主要真菌性病害之一[1]，引起柑橘炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloesporioides）。我國各柑橘種植區(qū)均有炭疽病的發(fā)生，可危害柑橘樹各部位，主要危害癥狀表現(xiàn)為大量落葉、落果、枝梢枯死和樹皮爆裂，嚴(yán)重時可造成植株死亡，影響果實的品質(zhì)和貯藏運輸[2-4]，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前柑橘炭疽病的防治仍已化學(xué)藥劑防治為主，用于柑橘炭疽病防治的登記農(nóng)藥產(chǎn)品共有137個，其中主要以咪鮮胺、代森錳鋅和嘧菌酯為主導(dǎo)[5]。相同成分殺菌劑的反復(fù)使用，可造成病原菌產(chǎn)生抗性，從而導(dǎo)致防效下降，甚至失效[6]。楊媚等[7]研究發(fā)現(xiàn)10個具有代表性的柑橘炭疽病單孢菌株對嘧菌酯和代森錳鋅都具有一定程度的抗藥性。因此，如何有效地防治柑橘炭疽病已成為柑橘種植產(chǎn)業(yè)中亟需解決的重要問題。蒲占湑等[8]發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯、嘧菌酯、咪鮮胺、唑醚·代森聯(lián)、甲基硫菌靈和丙森鋅對柑橘炭疽病菌菌絲抑制的EC50值分別為0.81、2.58、0.066、4.97、1555.15和237.98 μg/mL；陳建等[9]發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑與嘧菌酯質(zhì)量比為1∶1.6的混合物對抑制炭疽病菌菌絲生長最明顯，在大田藥效試驗中，2種藥劑質(zhì)量比1∶1.6混用對瑞昌山藥炭疽病的防效最好；張帥等[10]研究發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯質(zhì)量比為2∶1混用，對祁山藥炭疽病的防效明顯。苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病均有分開報道，但未見不同配比對柑橘炭疽病毒力及田間防效的報道。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，在室內(nèi)開展苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病菌的聯(lián)合毒力，從柑橘葉片和果實發(fā)病情況來調(diào)查2種藥劑及其混合物的田間防效。通過本研究，旨在明確2種藥劑增效作用的最佳配比及田間防效，為新農(nóng)藥的開發(fā)、柑橘炭疽病防治藥劑的選擇和使用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

膠孢炭疽菌，帶病葉片采自廣西省桂林市平樂縣，于實驗室內(nèi)進(jìn)行病原菌分離，得到的菌株經(jīng)過純化后，再進(jìn)行單孢分離，采用PDA培養(yǎng)基保種并培養(yǎng)于4℃冰箱。

1.1.2 供試藥劑

99%苯醚甲環(huán)唑原藥，湖北玖豐隆化工有限公司；98%吡唑醚菌酯原藥，山東穗泰生物科技有限公司；40%苯醚甲環(huán)唑乳油，山東貴合生物科技有限公司；30%吡唑醚菌酯乳油，青島星牌作物科學(xué)有限公司。

1.1.3 PDA培養(yǎng)基配方

每1000 mL水中加入去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病菌的室內(nèi)毒性測定

試驗方法參照NY/T 1156.2—2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》[11]中的平皿法進(jìn)行。分別稱取一定量的苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯原藥，被丙酮溶解后用0.1%的吐溫80水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為200 mg/L。取20、18、10、6、4 mL苯醚甲環(huán)唑溶液分別加入到4、6、10、18、20 mL吡唑醚菌酯溶液中，制成200 mg/L苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度比為5∶1、3∶1、1∶1、1∶3和1∶5的混合溶液，再用0.1%的吐溫80水 溶 液 稀 釋 成50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/L備用；苯醚甲環(huán)唑用0.1%的吐溫80水溶液稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/L；吡唑醚菌酯用0.1%的吐溫80水溶液稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L，空白對照為0.1%的吐溫80水溶液。取配制的各濃度藥液3 mL，加入冷卻至40℃左右的27 mL PDA培養(yǎng)基中，制成含藥培養(yǎng)基平板。然后從培養(yǎng)7 d的柑橘炭疽病菌菌落邊緣制取直徑為5 mm的菌餅，移至各含藥培養(yǎng)基上，菌絲面朝上，每處理4次重復(fù)。處理完畢，置于28℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后用卡尺十字交叉法垂直測量菌落直徑，取其平均值，按式（1）計算生長抑制率。

1.2.2 聯(lián)合毒力評價

參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》[11]，采用增效系數(shù)（SR）來進(jìn)行聯(lián)合毒力的測定，按式（2）～（3）分別計算EC50（理論值）和SR。

式中：A和B分別表示苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯占兩者質(zhì)量總和的百分比，%；SR＜0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR＞1.5為增效作用。

1.2.3 田間藥效試驗

試驗地設(shè)在廣西省桂林市平樂縣平樂鎮(zhèn)高埠村，品種為早熟蜜桔。試驗時為柑橘幼果期，生長均勻一致，期間未施用其他殺菌劑，土壤為灰泥田土，常規(guī)水肥管理，施藥時為發(fā)病初期。40%苯醚甲環(huán)唑乳油、30%吡唑醚菌酯乳油及其混合物（根據(jù)聯(lián)合毒力評價結(jié)果，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯按有效成分質(zhì)量比1∶1混合）田間施藥濃度設(shè)計為2000倍液和3000倍液，同時設(shè)置清水對照。每處理4個重復(fù)，每重復(fù)2棵柑橘樹，充分搖勻后，采用常規(guī)噴霧法，由低濃度向高濃度均勻噴霧，施藥量為2 L/株樹，噴霧至藥液噴濕葉片但不滴落，共施藥2次，間隔10 d。在第1次施藥當(dāng)天調(diào)查病情指數(shù)以及第2次施藥后第14 d調(diào)查施藥后病害發(fā)生情況。采取五點取樣法，每點各取2個枝條和6個果，記錄總?cè)~數(shù)、發(fā)病葉（果）數(shù)和發(fā)病級數(shù)，按式（4）～（5）分別計算病情指數(shù)和防效。葉分級方法為0級：無病斑；1級：每葉有病斑1～5個；3級：每葉有病斑6～10個；5級：每葉有病斑11～15個；7級：每葉有病斑16～20個；9級：每葉有病斑21個以上。果分級方法為0級：無??；1級：病斑相連面積占整個果面積5%以下；3級：病斑相連面積占整個果面積6%～10%；5級：病斑相連面積占整個果面積11%～25%；7級：病斑相連面積占整個果面積26%～50%；9級：病斑相連面積占整個果面積51%以上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病的聯(lián)合毒性

根據(jù)菌落生長抑制情況來分析評價苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯混合物的聯(lián)合毒性，以處理濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)x，菌落生長抑制率幾率值作為縱坐標(biāo)y進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)各處理皆具有良好的線性關(guān)系，詳見表1。試驗過程中，各處理菌落大小與空白對照組相比較，均受到不同程度的抑制作用，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯質(zhì)量配比為1∶1時，其對菌落大小的抑制最為明顯。

表1 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯對柑橘炭疽病的室內(nèi)毒性測定結(jié)果

按照Wadley法[11]，根據(jù)增效系數(shù)來評價苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯2種藥劑混用的增效作用可知，當(dāng)2種藥劑質(zhì)量配比為5∶1、3∶1、1∶3、1∶5時，其增效系數(shù)在0.980～1.1010之間，處于0.5～1.5范圍內(nèi)，則2種藥劑的聯(lián)合作用類型為相加作用；當(dāng)質(zhì)量配比為1∶1時，實測EC50值為0.525 mg/L，低于苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯分別對炭疽病原菌的EC50值，增效系數(shù)為1.658，大于1.5，2種藥劑的聯(lián)合作用類型為增效作用，故可視為苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯的最佳配比。

2.2 田間藥效試驗

柑橘葉片的病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果見表2。施藥前，柑橘園炭疽病處于發(fā)病初期，各處理的藥前病情指數(shù)均小于1，清水對照為0.653±0.125，各組間無顯著差異。在藥后14 d進(jìn)行結(jié)果調(diào)查發(fā)現(xiàn)，清水對照病情指數(shù)為9.275±0.451，明顯高于各處理組，且與各處理組相比顯著升高。相同藥劑不同稀釋倍數(shù)之間的病情指數(shù)也具有顯著差異，其中40%苯醚甲環(huán)唑乳油2000倍液病情指數(shù)最小，為0.953±0.126，與混合物（A∶B=1∶1）2000倍液的病情指數(shù)相近，且無顯著性差異。柑橘果實的病情指數(shù)結(jié)果見表3。施藥前，各處理的病情指數(shù)無顯著性差異，其最大值為1.759±0.355，藥后14 d調(diào)查發(fā)現(xiàn)，清水對照病情指數(shù)為15.370±0.642，與藥前相比增加了約10倍，與各處理組相比具有顯著性差異。和葉片病情指數(shù)情況一樣，40%苯醚甲環(huán)唑乳油2000倍液的病情指數(shù)最小，與混合物（A∶B=1∶1）2000倍液的病情指數(shù)相近，組間無顯著性差異。

表2 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯復(fù)配對柑橘葉片炭疽病的田間防效

表3 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯復(fù)配對柑橘果實炭疽病的田間防效

對于柑橘葉片上的炭疽病防效來說，40%苯醚甲環(huán)唑乳油和30%吡唑醚菌酯乳油及兩者混合物的稀釋倍數(shù)較小，其防效較好?？v觀整體，40%苯醚甲環(huán)唑乳油2000倍液防效最好，防效為89.07%±2.00%，其次為2種藥劑質(zhì)量比1∶1的混合物2000倍液，防效為87.16%±1.61%，2組防效之間無顯著性差異，說明40%苯醚甲環(huán)唑乳油2000倍液與苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯按質(zhì)量比1∶1的混合物2000倍液對柑橘葉片炭疽病的防效接近?；旌衔?000倍液時的防效與30%吡唑醚菌酯乳油2000倍液和40%苯醚甲環(huán)唑乳油3000倍液的防效接近，無顯著性差異。根據(jù)防效及其顯著性差異分析可得，在苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯質(zhì)量比1∶1的混合物相同稀釋倍數(shù)下，其防效略低于40%苯醚甲環(huán)唑乳油，但相同稀釋倍數(shù)下無顯著性差異，和相同稀釋倍數(shù)的吡唑醚菌酯防效相比較卻有顯著性提高。

該藥劑在果實上的整體防效低于葉片上的防效，但防治趨勢基本一致。最高防效為40%苯醚甲環(huán)唑乳油2000倍液，防效為84.408%±6.91%，與苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯質(zhì)量比1∶1的混合物2000倍液的防效無顯著性差異，說明其防效接近。根據(jù)防效及其顯著性差異分析可得，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯質(zhì)量比1∶1的混合物在相同稀釋倍數(shù)下，其防效略低于苯醚甲環(huán)唑，但無顯著性差異，和相同稀釋倍數(shù)的吡唑醚菌酯相比較，也無顯著性差異，但防效升高。

3 結(jié)論與討論

柑橘炭疽病是柑橘管理過程中的重大病害，發(fā)病幾率大，可通過加強栽培管理，如開溝排濕、配方施肥、修剪枝條等方式減少炭疽病的發(fā)生和蔓延[12]，但化學(xué)農(nóng)藥防治仍然是目前主要的防治方式。長期單一地使用化學(xué)農(nóng)藥容易誘導(dǎo)病原菌對其產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致防效下降。植物病原物抗藥性的進(jìn)化已經(jīng)成為農(nóng)作物病害防治中的重大威脅[13]。因此，篩選活性高的單劑農(nóng)藥或復(fù)配劑已經(jīng)成為防治病蟲害的重要方式，復(fù)配劑不僅能增加防效、擴大防治譜，還能延緩或克服抗藥性[14]。

苯醚甲環(huán)唑是一種廣譜的三唑類殺菌劑，是甾醇脫甲基化抑制劑，具有高效、安全、低毒等特點，廣泛用于真菌病害的防治[15]。吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其廣譜、高效、毒性低，對卵菌、真菌等引起的植物病害均有效，對非靶標(biāo)生物安全，對使用者和環(huán)境均安全友好[16]。在本次室內(nèi)毒力測定中，苯醚甲環(huán)唑的EC50實測值為0.593 mg/L，姜于蘭等[17]研究發(fā)現(xiàn)10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對柑橘炭疽病原菌的EC50值為0.0212 μg/mL，其毒性遠(yuǎn)高于本研究，可能在于不同采集地的病原菌對同一藥劑的抗性有所差異，而楊媚等[7]研究結(jié)果為0.3599 mg/L，與本研究結(jié)果接近；吡唑醚菌酯的EC50實測值為1.635 mg/L，與蒲占湑等[8]研究得到的0.81 mg/L相比，是其2倍。苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯以1∶1的質(zhì)量比混合時，在室內(nèi)毒力測定中具有明顯的增效作用。因此，本文進(jìn)行了苯醚甲環(huán)唑單劑、吡唑醚菌酯單劑及兩者質(zhì)量比1∶1混合物的田間藥效試驗，以此來評價2種單劑與其混合物的防效關(guān)系。

在田間藥效試驗中，陳怡志等[18]發(fā)現(xiàn)將咪鮮胺與苯醚甲環(huán)唑混配后，其對柑橘炭疽病的防效均優(yōu)于2種單劑的單獨防效；宋曉兵等[19]研究發(fā)現(xiàn)將吡唑醚菌酯和二氰蒽醌混配后，其對香蕉炭疽病的防效高于2種單劑。些說明在田間試驗中，2種成分的混用、混配同樣也具有一定的增效作用。在本研究中，綜合葉片及果實上炭疽病的防效發(fā)現(xiàn)，相同稀釋倍數(shù)下，苯醚甲環(huán)唑單劑的防效最好，吡唑醚菌酯單劑的防效最差，兩者質(zhì)量比1∶1混合物的防效居中，但通過差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，其與苯醚甲環(huán)唑單劑的防效無顯著性差異（P＜0.05），說明相同倍液下，混合物與苯醚甲環(huán)唑能達(dá)到相近的防效，在2000倍液時，其對葉和果的防效均超過80%。此外，本次田間藥效試驗只進(jìn)行2次施藥，若采用3次施藥，苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯混合物的防效會更好。推薦對柑橘炭疽病采用3次施藥[18]、每次間隔7 d來進(jìn)行防治。綜上所述，苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯質(zhì)量比1∶1時，增效明顯，且防效較好，能避免長期單一大量使用某一藥劑而引起病原菌產(chǎn)生抗性可以推廣使用。與此同時，和使用單劑相比較，混配劑在同樣的防效條件下還能減少各成分的使用劑量，減少對環(huán)境的污染。