葡萄籽原花青素及其柔性納米脂質(zhì)體的抗氧化及對酪氨酸酶活性的抑制作用*

竇 晨，丁 雄，潘 蕊，趙聲蘭，程 欣，3△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

人體黑色素的合成受黑色素生成途徑中的多種黑素體蛋白和酶的調(diào)控［1］，包括酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1和多巴色素互變異構(gòu)酶等。酪氨酸酶可催化2個(gè)黑色素生成的限速步驟，即酪氨酸羥基化為3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）和將L-DOPA氧化為多巴醌［2］，故黑色素的產(chǎn)生主要依賴于酪氨酸酶的表達(dá)和激活［3］。生理劑量的自由基在黑色素生成的最后階段能加速5，6-二羥基吲哚和吲哚醌之間的反應(yīng)，從而刺激黑色素的生成，增加皮膚的色素沉著［4］。葡萄籽原花青素（GSP）是從葡萄籽中提取的多酚化合物，是天然、低成本的抗氧化劑，具有抗氧化［5］、清除自由基［6］等藥理學(xué)活性，但分子結(jié)構(gòu)中的不飽和鍵降低了其儲存的穩(wěn)定性［7］。將GSP包載于柔性納米脂質(zhì)體（FL）中，可增加其穩(wěn)定性和功能性。本研究中探討了GSP及GSP-FL的抗氧化活性，以及對酪氨酸酶活性的影響，為制備具有美白功效的化妝品制劑提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試劑與細(xì)胞

1.1 儀器

OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（倍捷科技<上海>有限公司）；90Plus型納米激光粒度儀（美國布魯克海文儀器公司）；Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機(jī)，Multiskan型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美國奧豪斯公司，精度為0.0001 g）；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PI80H型超聲波處理器（德國Elma公司）。

1.2 試劑

GSP（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，批號為002200604028，純度不低于95%）；大豆卵磷脂（批號為1112J021），四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號為715F051），均購自北京索萊寶科技有限公司；膽固醇（批號為624J033），脫氧膽酸鈉（批號為909P021，純度大于99%），均購自北京蘭杰柯科技有限公司公司；L-酪氨酸（批號為RH221350），酪氨酸酶（批號為R002875），三吡啶三吖嗪（TPTZ，批號為R012773），均購自上海凜恩科技發(fā)展有限公司；L-DOPA（美國Sigma公司，批號為WXBD0797V）；曲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為12002059）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基（上海源葉生物有限公司，批號為S28J12M138964）；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，梯希愛<上海>化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號為KZTCI-AE）；曲拉通X-100（TritonX-100，美國Amresco公司，批號為21B1756838）；2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物（PTIO，九鼎化學(xué)<上海>科技有限公司，批號為YCLQJNY）；七 水 合 硫 酸 亞 鐵（FeSO4，批 號 為20200918），過氧化氫（H2O2，批號為20210201），均購自廣東光華科技股份有限公司；水為超純水。

1.3 細(xì)胞

小鼠永生化黑色素細(xì)胞系Melan-a細(xì)胞來源于廣州醫(yī)科大學(xué)，由云南中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室培養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GSP-FL的制備（薄膜分散-超聲法）

稱取卵磷脂250 mg、膽固醇17 mg，精密稱定，分別溶于15 mL氯仿；稱取脫氧膽酸鈉15 mg，溶于5 mL甲醇，超聲溶解。將上述3種溶液置圓底燒瓶中，混勻。40℃水浴條件下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑，直至燒瓶內(nèi)壁形成干燥、透明的均勻薄膜。稱取GSP 80 mg，溶于6 mL水，置圓底燒瓶中，40℃水浴條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)30 min，冰浴條件下超聲（功率為150～180 W，頻率為20～25 kHz）處理5 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，4℃條件下密封保存。在前期優(yōu)化制備工藝的基礎(chǔ)上制備GSP-FL［8］，采用超速離心法測定，其包封率為（70.79±0.02）%，載藥量為（1.16±0.01）%，粒徑為（156.47±7.03）nm，多 分 散系數(shù)為0.26±0.01，Zeta電位為-（42.35±4.00）mV。

2.2 GSP及GSP-FL的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率測定

取DPPH自由基2 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。采用80%乙醇溶解維生素C（VC），采用無水乙醇溶解GSP及GSP-FL，配制成質(zhì)量濃度分別為3.13，6.25，12.5，25，50 μg/mL的待測試樣溶劑。于96孔板［9］中加入各反應(yīng)液，50 μL待測試樣溶劑和150 μL DPPH自由基溶液為A0，150 μL DPPH自由基溶液及50 μL待測試樣為A1，50 μL待測試樣和150 μL待測試樣溶劑為A2。37℃條件下反應(yīng)30 min，采用酶標(biāo)儀于519 nm波長處測定吸光度。VC為陽性對照，A2為空白對照，以空白柔性納米脂質(zhì)體（EL）排除脂質(zhì)體對吸光度的干擾。DPPH自由基清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%。采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

結(jié)果見圖1?？梢?，在3.13～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC，GSP，GSP-FL對DPPH自由基的清除率均逐漸增加；對DPPH自由基的IC50分別為（15.277±2.392）μg/mL、（9.791±0.615）μg/mL、（9.271±0.424）μg/mL。GSP與GSP-FL表現(xiàn)出比VC更好的DPPH自由基清除活性。EL對DPPH自由基的活性無影響。

圖1 GSP，GSP-FL，VC對DPPH自由基的清除率Note：Compared with Vc，aP<0.05（for Fig.1-4）.Fig.1 Scavenging rates of GSP，GSP-FL and VC on the DPPH free radical

2.2.2 ABTS+自由基清除率測定［10］

取過硫酸鉀13.40 mg和ABTS 38.40 mg，精密稱定，分別置25 mL容量瓶中，用純水充分溶解并定容，置燒杯中1∶1混勻，室溫避光放置12 h，即得ABTS+自由基貯備液；使用前用純水稀釋10～20倍，直至吸光度為0.70±0.02，即得ABTS+自由基工作液。采用80%乙醇溶解VC，采用無水乙醇溶解GSP及GSP-FL，配制成質(zhì)量濃度分別為1.56，3.13，6.25，12.5，25 μg/mL的溶液。于96孔板中加入各反應(yīng)液，75 μL待測試樣溶劑和75 μL ABTS+自由基工作液為A0，75 μL ABTS+自由基工作液及75 μL待測試樣為A1，75 μL待測試樣和75 μL待測試樣溶劑為A2。室溫下反應(yīng)6 min，采用酶標(biāo)儀于734 nm波長處測定吸光度。VC為陽性對照，A2為空白對照。ABTS+自由基清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%。

結(jié)果見圖2。可見，在1.56～25 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC，GSP，GSP-FL對ABTS+自由基的清除率均逐漸增加；對ABTS+自由基的IC50分別為（12.387±1.79）μg/mL、（10.722±1.80）μg/mL、（10.403±2.33）μg/mL。GSP，GSP-FL，VC的ABTS+自由基清除活性相似。EL對ABTS+自由基的活性無影響。

圖2 GSP，GSP-FL，VC對ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of GSP，GSP-FL and VC on the ABTS+free radical

2.2.3 PTIO自由基清除率測定［11］

取PTIO自由基10 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用純水定容，即得PTIO自由基工作液。用純水溶解VC，GSP，GSP-FL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.0125，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL的溶液。于96孔板中加入各反應(yīng)液，40 μL純水和160 μL PTIO自由基工作液為A0，160 μL PTIO自由基工作液及40 μL待測試樣為A1，40 μL待測試樣和160 μL純水為A2。37℃條件下靜置30 min，采用酶標(biāo)儀于557 nm波長處測定吸光度。以VC為陽性對照。PTIO自由基清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%。

結(jié)果見圖3?？梢?，在0.0125～0.4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC，GSP，GSP-FL對PTIO自由基的清除率均逐漸增加；對PTIO自由基的IC50分別為（0.097±0.001）mg/mL、（0.220±0.056）mg/mL、（0.187±0.037）mg/mL。GSP與GSP-FL表現(xiàn)出對PTIO自由基的清除活性，但效果不如VC。GSP-FL質(zhì)量濃度為0.0125～0.1 mg/mL時(shí)，對PTIO自由基的清除率顯著高于VC（P<0.05）。EL對PTIO自由基的活性無影響。

圖3 GSP，GSP-FL，VC對PTIO自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of GSP，GSP-FL and VC on the PTIO free radical

2.2.4 鐵離子（Fe3+）還原能力測定［10］

取TPTZ粉末7.8 mg，精密稱定，溶于2.5 mL 40 mmol/L鹽酸溶液中，超聲（功率為80 W，頻率為40 kHz）使其完全溶解，即得10 mmol/L TPTZ溶液；取27.029 mg氯化鐵，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，即得10 mmol/L氯化鐵溶液；將300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和10 mmol/L氯化鐵溶液按10∶1∶1混勻，即得Fe3+抗氧化能力工作液。取FeSO450.59 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，梯度稀釋成濃度分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。在96孔板中加入不同濃度的FeSO4溶液20 μL，再加入180 μL Fe3+抗氧化能力工作液，在37℃條件下恒溫孵育6 min，采用酶標(biāo)儀于593 nm波長處測定吸光度。以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.009X+0.2084（R2=0.9927，n=7）。在96孔板中加入20 μL質(zhì)量濃度分別為0.05，0.1，0.2 mg/mL的GSP，GSP-FL，VC溶液，再加入180 μL Fe3+抗氧化能力工作液，37℃條件下恒溫孵育6 min，采用酶標(biāo)儀于593 nm波長處測定吸光度。樣品溶液對Fe3+的還原能力以FeSO4含量表示，以VC為陽性對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定GSP，GSP-FL，VC溶液對Fe3+的還原能力。

結(jié)果見圖4。可見，在0.05～0.2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，GSP，GSP-FL，VC對Fe3+的還原能力均逐漸增強(qiáng)，但GSP和GSP-FL的還原能力不如VC。EL對Fe3+的還原能力無影響。

圖4 GSP，GSP-FL，VC對Fe3+的還原能力Fig.4 Reduction abilities of GSP，GSP-FL and VC on the Fe3+

2.3 GSP對H2O2誘導(dǎo)Melan-a細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.1 GSP及GSP-FL對Melan-a細(xì)胞的毒性（MTT法）

取處于對數(shù)生長期的Melan-a細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心（轉(zhuǎn)速為800 r/min）3 min，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為7.5×105/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱（溫度為37℃，CO2濃度為5%，下同）中培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基；每孔分別加入100 μL質(zhì)量濃度分別為0.0125，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL的GSP及GSP-FL溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。另設(shè)陰性對照組（等量的細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)液）與空白對照組（等量的細(xì)胞培養(yǎng)液），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的現(xiàn)配MTT溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，振搖10 min，充分溶解，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度。細(xì)胞抑制率（%）=［1-（AGSP/GSP-FLA空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）］×100%。

結(jié)果見圖5?？梢?，與GSP-FL相比，給藥24 h后，GSP質(zhì)量濃度為0.0125～0.8 mg/mL時(shí)的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，且48 h時(shí)的細(xì)胞毒性更強(qiáng)。給藥24 h和48 h后，GSP-FL的平均IC50為（0.443±0.09）mg/mL和（0.137±0.00）mg/mL，顯著高于GSP的（0.140±0.40）mg/mL和（0.049±0.01）mg/mL（P<0.05）。GSP-FL降低了游離藥物的細(xì)胞毒性，提高了細(xì)胞的存活率。故推測將GSP包載于FL中可顯著增加藥物的安全性。EL質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，對Melan-a細(xì)胞的抑制率為（25.2±9.99）%，隨著其不斷稀釋，抑制率降低，故EL毒性較低。

圖5 加入GSP和GSP-FL后Melan-a細(xì)胞的存活率（n=3）A.24 h B.48 hNote：Compared with those with GSP，bP<0.05.Fig.5 Survival rates of Melan-a cells after adding GSP and GSP-FL（n=3）

2.3.2 H2O2誘導(dǎo)Melan-a細(xì)胞氧化損傷模型的建立

取處于對數(shù)生長期的Melan-a細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液稀釋，直至細(xì)胞懸液的密度為5×104/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去上清液，每孔加入100 μL 25，50，100，200，400，800 μmol/L的H2O2溶液，造模8 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。另設(shè)陰性對照組（等量的細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)液）與空白對照組（等量的細(xì)胞培養(yǎng)液）。計(jì)算細(xì)胞抑制率。結(jié)果H2O2溶液濃度為25，50，100，200，400，800 μmol/L時(shí)，Melan-a細(xì)胞抑制 率 分 別 為（9.11±5.81）%、（16.69±9.60）%、（40.95±3.52）%、（63.18±4.64）%、（91.09±3.04）%、（93.21±2.26）%（n=3）。

2.3.3 GSP對H2O2誘導(dǎo)Melan-a細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用（MTT法）［12］

前期試驗(yàn)考察了150，250 μmol/L H2O2的作用，結(jié)果其濃度為250 μmol/L時(shí)，GSP組的保護(hù)作用與模型組相比，具有顯著差異（P<0.05）。故將細(xì)胞分為4組，即陰性對照組（等量的細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)液）、空白對照組（等量的細(xì)胞培養(yǎng)液）、模型組（250 μmol/L H2O2）、不同質(zhì)量濃度（6.25，12.5，25，50 mg/mL）的GSP組。按2.3.2項(xiàng)下方法將Melan-a細(xì)胞均勻接種于96孔板，空白對照組僅加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄去上清液。GSP組分別加入含不同質(zhì)量濃度GSP的培養(yǎng)液100 μL，在空白對照組、陰性對照組和模型組中加入等量的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄去上清液。在模型組和GSP組中分別加入100 μL 250 μmol/L的H2O2溶液，在空白對照組、陰性對照組中加入等量培養(yǎng)液。將96孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

結(jié)果見圖6。可見，與模型組比較，GSP質(zhì)量濃度為12.5～50 mg/mL時(shí)，能顯著增加H2O2造成的氧化損傷細(xì)胞的存活率（P<0.05）；但GSP質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，其保護(hù)作用低于25 mg/mL，推測在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，H2O2對細(xì)胞仍有一定毒性。由于FL減少了H2O2與細(xì)胞的直接接觸，降低了藥物對細(xì)胞的刺激性。

圖6 不同GSP質(zhì)量濃度對氧化損傷Melan-a細(xì)胞存活率的影響Note：Compared with those in the model group，cP<0.05.Fig.6 Effects of GSP with different mass concentrations on the survival rates of oxidatively damaged Melan-a cells

2.4 GSP和GSP-FL對體外酪氨酸酶活性的影響

2.4.1 對酪氨酸酶單酚酶及二酚酶活性的影響

以2.0 mmol/L的酪氨酸溶液或2.0 mmol/L的L-DOPA為底物，按表1進(jìn)行反應(yīng)，采用96孔板，在200 μL測活體系中加入濃度為2.0 mmol/L的酪氨酸溶液（或L-DOPA）和磷酸鹽緩沖液，置37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min，加入質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL的GSP，GSP-FL溶液各50 μL及質(zhì)量濃度為0.003，0.006，0.012，0.025，0.05 mg/mL的曲酸溶液50 μL，加入質(zhì)量濃度為150 U/mL酪氨酸酶溶液50 μL，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)15 min，采用酶標(biāo)儀于475 nm波長處測定吸光度。抑制率（%）=［(A1-A2)-(A3-A4)］/（A1-A2）×100%。

表1 體外酪氨酸酶活性試驗(yàn)反應(yīng)液組成（μL）Tab.1 Composition of reaction solution for tyrosinase activity test（μL）

結(jié)果顯示見圖7?？梢?，曲酸質(zhì)量濃度低于0.05 mg/mL時(shí)，對酪氨酸單酚酶及二酚酶活性均有抑制作用；GSP和GSP-FL對酪氨酸酶活性的抑制作用均隨質(zhì)量濃度的升高而降低。GSP-FL對酪氨酸單酚酶的IC50約為GSP的2倍，對酪氨酸二酚酶的IC50約為GSP的3.5倍。詳見表2。

圖7 GSP和GSP-FL、曲酸對酪氨酸酶單酚酶及二酚酶的活性作用Fig.7 Effects of GSP，GSP-FL and kojic acid on the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase

表2 對酪氨酸酶單酚酶及二酚酶作用的IC50（±s，mg/mL）Tab.2 IC50 of GSP，GSP-FL and kojic acid on the monophenolase and diphenolase of tyrosinase（±s，mg/mL）

表2 對酪氨酸酶單酚酶及二酚酶作用的IC50（±s，mg/mL）Tab.2 IC50 of GSP，GSP-FL and kojic acid on the monophenolase and diphenolase of tyrosinase（±s，mg/mL）

注：與曲酸比較，dP<0.05。表3和表4同。Note：Compared with those with kojic acid，dP<0.05（for Tab.2-4）.

試劑GSP GSP-FL曲酸酪氨酸二酚酶0.294±0.011.057±0.03d 0.024±0.01酪氨酸單酚酶0.243±0.000.503±0.08d 0.010±0.00

2.4.2 酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)

固定底物L(fēng)-DOPA溶液的濃度為2 mmol/L，分別配制濃度為20，40，60，80，100 U/mL的酪氨酸酶溶液及質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg/mL的GSP溶液，按表1進(jìn)行反應(yīng)，測定GSP對酪氨酸酶的抑制機(jī)制，得到酶活性隨酶量變化的關(guān)系圖（圖8），酶活性對酶量是一條相對的直線，隨著待測樣品溶劑質(zhì)量濃度的升高，酶活性減少。提示GSP是通過抑制酶活性而不是減少有效酶量來降低對L-DOPA的催化效率的。

圖8 GSP對酪氨酸酶的抑制效應(yīng)機(jī)制Fig.8 Mechanism of inhibitory effect of GSP on tyrosinase

2.5 GSP和GSP-FL對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

2.5.1 Melan-a細(xì)胞胞內(nèi)酪氨酸酶抑制率［12-14］

取對數(shù)生長期的Melan-a細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為2.5×105/mL，并接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。加入含不同質(zhì)量濃度GSP、GSP-FL及曲酸的培養(yǎng)基，另設(shè)陰性對照（等量的細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)液）。培養(yǎng)24 h和48 h，棄去培養(yǎng)基，加入500 μL 1% TritonX-100溶液，靜置5 min。用細(xì)胞刮刀刮下每孔中的細(xì)胞，置冰面充分裂解1 h，冷凍，離心（轉(zhuǎn)速為14000 r/min）10 min。取上清液100 μL，加入96孔板中，置37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min。加入3 mmol/LL-DOPA溶液100 μL，繼續(xù)反應(yīng)1 h，采用酶標(biāo)儀于475 nm波長處測定吸光度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔（100 μL 1%TritonX-100和100 μL 3 mmol/LL-DOPA），重復(fù)3次 試 驗(yàn)。酪 氨 酸 酶 活 性（%）=（AGSP/GSP-FL/曲酸-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）×100%。

結(jié)果見表3。可見，隨著作用時(shí)間的增加，GSP及GSP-FL對酪氨酸酶活性的抑制作用均逐漸增強(qiáng)。24 h后，在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的GSP及GSP-FL作用下，Melan-a細(xì)胞胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于曲酸（P<0.05）；48 h后，在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的GSP及GSP-FL作用下，Melan-a細(xì)胞胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于曲酸（P<0.05）。

表3 GSP及GSP-FL、曲酸對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響（n=3）Tab.3 Effects of GSP，GSP-FL and kojic acid on the activity of intracellular tyrosinase（n=3）

2.5.2 Melan-a細(xì)胞胞內(nèi)黑色素含量

取對數(shù)生長期的Melan-a細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為2.5×105/mL，并接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。加入含不同質(zhì)量濃度GSP-FL及曲酸的培養(yǎng)基，另設(shè)陰性對照組（等量的細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h或48 h，棄去培養(yǎng)基。加入500 μL 1%TritonX-100溶液，靜置5 min，用細(xì)胞刮刀刮下每孔中的細(xì)胞，置冰面上充分裂解1 h，冷凍，離心（轉(zhuǎn)速為14000 r/min）10 min。取離心后的細(xì)胞黑色素沉淀，加入100 μL 1 mol/L NaOH溶液（含10%二甲基亞砜）中，80℃條件下加熱1 h至完全溶解，采用酶標(biāo)儀于405 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)。黑色素含量（%）=（AGSP-FL/曲酸）/A陰性對照組×100%。

結(jié)果見表4?？梢?，隨著GSP-FL質(zhì)量濃度的升高和作用時(shí)間的延長，黑色素的合成均減少。24 h后，GSP-FL質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，Melan-a細(xì)胞胞內(nèi)黑色素含量顯著低于曲酸組（P<0.05）；48 h后，GSP-FL質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，細(xì)胞胞內(nèi)黑色素含量顯著低于曲酸組（P<0.05）。因藥物本身存在的顏色會干擾黑色素吸光度的測定，且無法通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行排除，故未對GSP進(jìn)行測定。

表4 GSP-FL對細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的影響（n=3）Tab.4 Effect of GSP-FL on the synthesis of intracellular melanin（n=3）

3 討論

多數(shù)體外抗氧化的檢測方法僅能評價(jià)化合物清除某一種自由基的能力，且各有優(yōu)、缺點(diǎn)，各種方法聯(lián)用才能更好地反映某化合物的抗氧化活性。本研究中通過測定GSP及GSP-FL對DPPH，ABTS+，PTIO自由基的清除能力及對Fe3+的還原能力，綜合評價(jià)其抗氧化活性，結(jié)果表明GSP及GSP-FL均具有良好的抗氧化活性，對DPPH和ABTS+自由基的IC50均低于VC。早有研究報(bào)道，GSP是比VC和維生素E琥珀酸乙酯更強(qiáng)的自由基清除劑［15］。GSP能顯著增加H2O2氧化損傷細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞的氧化損傷程度，但其作用機(jī)制需作進(jìn)一步研究。

體外酶學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，GSP和GSP-FL均表現(xiàn)出對酪氨酸單酚酶及二酚酶的抑制作用；但GSP-FL對酪氨酸單酚酶及二酚酶的抑制率顯著低于GSP，推測可能是由于FL外殼對藥物的保護(hù)作用，在缺乏破乳劑的情況下，藥物未突釋出來。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，GSP會抑制正常Melan-a細(xì)胞的增殖，將GSP包載于FL中，顯著降低了藥物的細(xì)胞毒性。推測可能是由于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層外殼較安全，可減少藥物與細(xì)胞的直接接觸，從而降低了藥物對細(xì)胞的刺激性。在細(xì)胞試驗(yàn)中，GSP及GSP-FL表現(xiàn)出對Melan-a細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性、黑色素生成的抑制作用。皮膚美白劑的功能應(yīng)在安全的藥物劑量下減少細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成，不能因?yàn)檫^多的黑色素細(xì)胞死亡而使局部的皮膚顏色變淺，影響美觀，甚至在無黑色素的保護(hù)作用下，導(dǎo)致皮膚曬傷［16-17］。GSP-FL在抑制細(xì)胞胞內(nèi)酪氨酸酶活性和黑色素生成的同時(shí)，降低了細(xì)胞毒性，減少了黑色素細(xì)胞的死亡。

綜上所述，GSP-FL具有清除自由基、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的作用，相比游離GSP和GSP-FL還能降低對正常細(xì)胞的毒性。有望將GSP-FL進(jìn)一步開發(fā)成凝膠劑、乳膏劑等具有美白功效的化妝品制劑，但美白是多重酶、多種因素共同作用的結(jié)果，其藥理作用和藥效機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。