自動(dòng)膜芯片法檢測植物蛋白飲料源性成分

李羽翡

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030）

植物蛋白飲品的開發(fā)豐富了我國乳制品市場，其因含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸而受到廣大消費(fèi)者喜愛[1-2]。隨著食品原料價(jià)格的上漲，部分生產(chǎn)企業(yè)為了降低生產(chǎn)成本，利用廉價(jià)植物原料替代或摻入原產(chǎn)品中，以次充好，例如央視在2018年“3·15”晚會(huì)中曝光了多家企業(yè)生產(chǎn)核桃露時(shí)使用成本較低的其他堅(jiān)果醬或香精香料代替核桃濃漿。類似行為擾亂了正常的食品加工市場，嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的利益[3-6]，且有些消費(fèi)者對個(gè)別植物源性成分存在過敏現(xiàn)象，如果未按事實(shí)添加或標(biāo)注，有可能誘發(fā)消費(fèi)者發(fā)生過敏反應(yīng)，后果不堪設(shè)想[7]。

目前針對植物蛋白飲料中源性成分鑒偽的鑒定主要集中于ELISA、色譜和質(zhì)譜技術(shù)以及包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR、凝膠電泳、基因組文庫、DNA條形碼等在內(nèi)的諸多分子生物學(xué)技術(shù)[8-16]。膜芯片檢測技術(shù)將探針固定在膜表面，利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交形成可視化的斑點(diǎn)，因此具有快速、簡便、高通量、高效率等特點(diǎn)，被越來越多的應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本文采用全自動(dòng)膜芯片方法，可對9種植物源性成分進(jìn)行同時(shí)檢測，完成了蘭州地區(qū)市售24份標(biāo)識含有胡桃（核桃）、花生、杏仁、榛子、大豆、胡蘿卜等源性成分的核桃露乳、杏仁露、胡蘿卜汁等植物蛋白飲料的源性成分檢測。甘肅省蛋白飲料源性成分鑒定還處于初級階段，本研究針對蘭州地區(qū)市售植物源性飲料進(jìn)行摸底調(diào)查，以期為監(jiān)管部門的日常監(jiān)管工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市售核桃露、杏仁露、胡蘿卜汁等植物飲品，覆蓋蘭州市70%以上的植物蛋白飲品。采用隨機(jī)取樣方法，采集樣品共計(jì)26份，每份2瓶，樣品包裝完好，樣品信息如表1所示。

表1 采樣明細(xì)表

試劑：Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）（Ta KaRa）、DNeasy mericon Food Kit（QIAGEN）、50 ml錐形離心管（Axygen）、TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer solutionshangbao上海愛必信）。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備：PCR儀（S 1000TM）（Bio-rad伯樂）；Nano DropTMOne/One C超微量紫外-可見光分光光度計(jì)（Thermo Scientific）；Megafuge 8/8R離心機(jī)（Thermo Scientific）；MFS-8系列膜芯片雜交儀器（四川華漢）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀H 2500 R）。

1.3 探針引物

本實(shí)驗(yàn)引物探針來源如下：腰果引物探針來源于腰果AnaO3致敏蛋白基因，杏仁來源于杏仁Pru dul基因，大豆來源于大豆lectin基因，開心果來源于開心果18SrRNA與5.8SrRNA基因間區(qū)，胡蘿卜來源于胡蘿卜抗凍蛋白基因，榛子來源于oleosin基因，芝麻來源于管家基因2S albumin mRNA，胡桃來源于過敏原蛋白Jug r2基因，內(nèi)參及探針來源于真核生物18SrRNA基因。采用商品化食源性植物過敏原膜芯片檢測試劑盒（配套儀器-華漢MFS-8系列儀器）。

2 分析方法

2.1 DNA提取與擴(kuò)增

取40 ml飲料樣品裝入Axygen 50 ml錐形離心管，用高速冷凍離心機(jī)13000 rpm離心20 min。使用凱杰深加工食品核酸提取試劑盒提取基因組DNA，用NanoDrop紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度，DNA的吸光值A(chǔ)260/A280比值介于1.8～2.0才可保證多重PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率。

2.2 多重PCR擴(kuò)增程序

使用華漢MFS-8儀器配套食源性植物過敏原膜芯片檢測試劑盒，反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃15 s（30個(gè)循環(huán)）；68℃15 s；4℃保溫；總體系為20 μl。

2.3 膜芯片雜交顯色

將2.2階段多重PCR產(chǎn)物95℃變性5 min，置于冰上備用。

按照植物過敏原膜芯片檢測試劑盒的操作步驟，配套華漢MFS-8膜芯片雜交儀器，使用商品化的膜芯片進(jìn)行去活化、清洗、雜交、孵育、洗膜和顯色操作。

2.4 結(jié)果判定

將含有核桃、花生、杏仁、胡蘿卜、芝麻、榛子、大豆、腰果、開心果源性成分的物種樣品進(jìn)行基因提取和擴(kuò)增，通過2.1—2.3的操作步驟雜交顯色，進(jìn)行特異性評估；使用TE緩沖液將上述9份含有源性成分的標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA分別稀釋至10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng 4個(gè)稀釋度測定膜芯片的靈敏度。將市售核桃露（乳）、杏仁露、果仁露、胡蘿卜汁等植物蛋白飲料同樣按2.1—2.3的步驟操作，分別進(jìn)行雜交顯色，實(shí)驗(yàn)完成后，膜芯片上內(nèi)參點(diǎn)和陽性對照PC點(diǎn)顯色，陰性對照NC點(diǎn)不顯色，代表結(jié)果有效。對照說明書中食源性植物過敏原膜芯片點(diǎn)陣圖進(jìn)行判讀，探針分布模式如圖1所示。

圖1 探針分布模式圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 特異性驗(yàn)證

對含有以下9種（核桃、芝麻、花生、杏仁、腰果、榛子、大豆、胡蘿卜、開心果）植物源性成分的物種樣品進(jìn)行DNA的提取、擴(kuò)增，以無菌水為空白對照，通過PCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物加樣到膜芯片雜交顯色試劑盒中，儀器操作雜交顯色。結(jié)果顯示，9種樣品DNA只與其相對應(yīng)的特異性源性基因發(fā)生顯色反應(yīng)，均被準(zhǔn)確識別，并且雜交點(diǎn)清晰可見，無漏檢、錯(cuò)檢、多檢現(xiàn)象（圖2）。說明該芯片方法特異性識別能力強(qiáng)，可用于9種源性成分的檢測鑒定。

圖2 9種植物基因膜芯片雜交結(jié)果

3.2 飲料樣品膜芯片雜交結(jié)果

圖3 為部分飲料的膜芯片雜交結(jié)果圖，涵蓋了樣品源性成分檢測的不同結(jié)果狀態(tài)。1號芯片檢出大豆源性成分；2號芯片既檢出花生源性成分，又檢出榛子源性成分；3號、4號芯片分別檢出核桃和杏仁源性成分；5號芯片檢出胡蘿卜成分；6芯片檢出花生和大豆源性成分；7號芯片僅檢出花生成分；8芯片既檢出杏仁，又檢出大豆成分；9號、10號未檢出源性成分；11號、12號是空白對照。樣品檢測結(jié)果如表2所示。

表2 樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖3 典型樣品膜芯片雜交結(jié)果

4 結(jié)論與討論

我國進(jìn)出口行業(yè)頒布了9種植物過敏原成分檢測標(biāo)準(zhǔn)，但每一個(gè)單一指標(biāo)就需要一項(xiàng)操作標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)際應(yīng)用中不宜推廣[17-25]。國家總局頒布的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 201707雖涵蓋4種植物源性成分指標(biāo)，但仍是單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，1次擴(kuò)增只能判讀1個(gè)數(shù)據(jù)指標(biāo)，對于大規(guī)模的數(shù)據(jù)篩查十分不利[26]。本試驗(yàn)采用商品化全自動(dòng)膜芯片檢測方法，該方法具備檢測速度快、上樣通量大、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于9種植物過敏原性成分的同時(shí)檢測[7，27-31]。

結(jié)果顯示，蘭州市售24份植物飲料中，有2份胡蘿卜汁未檢出植物源性成分，不合格率為7.7%，說明市售飲料中存在原料不實(shí)、以次充好的現(xiàn)象。因此，相關(guān)監(jiān)督管理部門應(yīng)因地制宜，針對不同產(chǎn)品的特點(diǎn)和問題隱患開展監(jiān)管工作。其余幾種堅(jiān)果類植物蛋白飲料未發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽不實(shí)或缺失源性成分的現(xiàn)象，說明本領(lǐng)域內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)可以做到規(guī)范生產(chǎn)、誠信經(jīng)營。此外，本次篩查工作只對源性成分進(jìn)行了檢測，無法確定在標(biāo)簽標(biāo)識之外是否添加了其他成分，這方面的工作還需要參考理化相關(guān)分析數(shù)據(jù)。因此，植物源性飲料的檢測工作任重道遠(yuǎn)，還需要進(jìn)一步深入研究。