HPLC 法測(cè)定人血清中游離比阿培南濃度及其在重癥感染中的臨床應(yīng)用

李博涵，彭秘，封傳華，任琦，陳集志，徐蘭

1.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908 醫(yī)院，江西 南昌 330002；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；4.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330029

比阿培南是一種新型1β-甲基碳青霉烯類抗菌藥物，通過結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白，能有效地經(jīng)細(xì)菌外膜滲透進(jìn)入周質(zhì)間隙，發(fā)揮強(qiáng)大的殺菌活性［1］，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌（G+菌）、革蘭陰性菌（G-菌）和厭氧菌等能發(fā)揮廣譜、強(qiáng)大的抗菌活性［2］，被廣泛用于特殊病理生理狀況的重癥感染患者的經(jīng)驗(yàn)性治療、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶G-桿菌引起的急慢性感染，臨床上較多地用于腹腔感染、呼吸道感染、敗血癥、婦產(chǎn)科感染、心內(nèi)膜炎及尿路感染［3］。比阿培南為時(shí)間依賴性抗菌藥物，發(fā)揮殺菌活性的前提是抗菌藥物濃度要達(dá)到某水平并維持較長(zhǎng)時(shí)間。比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度高于大多數(shù)G+菌、G-菌和厭氧菌的MIC90（抑制90%細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度），對(duì)非產(chǎn)酶腸桿菌科和敏感金葡菌的敏感率均大于90%［4］，但鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌這兩種病原菌的MIC90 可達(dá)到64、16 μg/mL［1］，高于比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度。因此，需監(jiān)測(cè)重癥感染患者中比阿培南的血藥濃度，按監(jiān)測(cè)結(jié)果制定個(gè)體化的給藥方案，提高臨床治療成功率。

藥物在血中呈游離狀態(tài)的部分能產(chǎn)生藥理效應(yīng)，能被機(jī)體轉(zhuǎn)化和排泄，更為準(zhǔn)確的做法是采用游離藥物濃度來評(píng)價(jià)藥效學(xué)和藥物不良反應(yīng)。本研究參考文獻(xiàn)［5-7］，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高的HPLC 法測(cè)定人血清中游離比阿培南濃度，并應(yīng)用于監(jiān)測(cè)ICU 患者比阿培南的血清濃度，為安全合理使用比阿培南提供參考。

1 儀器與試藥

LC-15C 型高效液相色譜儀（日本島津）；Millipore 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；DL-360D型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；AUW220D 型電子分析天平（日本島津）；TGL-16 型高速離心機(jī)（山東百歐醫(yī)療科技有限公司）；XH-B型微量渦旋混合器（上海汗諾儀器有限公司）；ST 3100 型pH 計(jì)（常州奧豪斯儀器有限公司）；移液槍（Thermo Fisher 公司）；超濾離心管（10kD,聚醚砜膜，美國(guó)Millipore 公司）。比阿培南對(duì)照品（批號(hào)：A137321337769，純度98.00%，APEXBio 公司）；注射用比阿培南（批號(hào)：201116125，規(guī)格：0.3 g，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS，批號(hào)：BCB28902，純度≥99.5%，美國(guó)sigma-Aldrich 公司）；醋酸銨（批號(hào)：20190620，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸鋅（批號(hào)：202031099，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)，批號(hào)：M14101008，規(guī)格：500 mL）；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L 醋酸銨緩沖液（pH4.6）（2∶98）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的配制

MOPS 溶液：精密稱取MOPS 25 mg，置50 mL棕色量瓶中，加適量水溶解，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值為7，再加水定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.5 mg/mL 的MOPS 溶液，4 ℃冷藏保存；比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取比阿培南對(duì)照品0.021 1 g，置25 mL 棕色量瓶中，用0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得校準(zhǔn)后濃度為0.827 1 mg/mL 的比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液，分裝于1.5 mL EP管中，-20 ℃冷凍保存。

2.3 樣品的處理

精密量取血清210 μL，加入0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液160 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min離心10 min，取下層濾液，進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)

A：取空白血清160 μL，加入0.5 mg/mL MOPS溶液（pH 7.0）210 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min 離心10 min，取下層濾液，進(jìn)樣分析。B：取空白血清160 μL，加比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備溶液50 μL，加入0.5 mg/mL MOPS（pH 7.0）溶液160 μL，渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，15 000 r/min 離心10 min，取下層濾液，進(jìn)樣分析。C：取患者用藥后的血清，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖1，比阿培南保留時(shí)間約為5.4 min，色譜峰形較好，2.5 min 左右的雜質(zhì)峰和其他內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)比阿培南峰型均不造成干擾。

圖1 HPLC色譜圖：A.空白血清；B.空白血清+比阿培南；C.患者血清

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用0.5 mg/mL MOPS 溶液（pH 7.0）稀釋并配制系列對(duì)照品濃度分別為0.81、1.62、6.46、12.92、25.85、51.69、103.39、206.77 μg/mL。精密量取空白血清160 μL，分別加入上述系列對(duì)照品溶液各50 μL，使比阿培南血清濃度分別為0.20、0.40、1.58、3.16、6.32、12.65、25.30、50.59 μg/mL，按“2.3”項(xiàng)處理，記錄色譜圖。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，血清中比阿培南濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得比阿培南的線性回歸方程為A=19 558C+531.15，r=0.999 9。定量下限為0.20 μg/mL。結(jié)果表明，比阿培南血清濃度在0.20～50.59 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的對(duì)照血樣，每個(gè)濃度各5 份，按“2.3”項(xiàng)處理，記錄色譜圖，由回歸方程計(jì)算得出測(cè)定濃度，方法回收率=測(cè)定濃度/理論濃度×100%，結(jié)果見表1。結(jié)果表明方法回收率均符合生物樣品分析要求。

2.7 精密度試驗(yàn)

分別配制濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對(duì)照血樣，每個(gè)濃度各5 份，按“2.3”項(xiàng)處理，分別在同一天內(nèi)測(cè)定5 次、每天測(cè)1 次連續(xù)3 天，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。比阿培南的日內(nèi)、日間精密度RSD 均＜8%，表明精密度符合生物樣品分析要求。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對(duì)照血樣，每個(gè)濃度各3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理。室溫穩(wěn)定性：室溫放置0、2、4、6、8、12 h；冷藏穩(wěn)定性：4 ℃冰箱冷藏放置48 h；凍融穩(wěn)定性：-20 ℃冰箱凍存，取出置室溫自然融化，再置-20 ℃凍存24 h，此步驟重復(fù)2 次，共進(jìn)行3 次。以上樣品均按“2.3”項(xiàng)下方法處理。結(jié)果顯示樣品連續(xù)凍融3 次后，比阿培南穩(wěn)定性有一定幅度下降，而凍融2 次穩(wěn)定性良好；室溫放置12 h、4 ℃下放置48 h、-20 ℃放置15 d 穩(wěn)定性良好（比阿培南濃度變化＜15%，RSD＜6.65%）。

3 治療藥物監(jiān)測(cè)

3.1 入選病例

本研究共納入病例69 例，藥敏試驗(yàn)提示為多重耐藥菌感染或（和）對(duì)碳青霉烯類敏感的重癥患者，年齡≥18 歲，使用比阿培南≥3 d。

3.2 樣本收集及療效判定

給藥方案為比阿培南0.6 g，加入50 mL 0.9%氯化鈉注射液中，輸液泵泵注2～3 h，每8 小時(shí)給藥一次。比阿培南血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)（用藥2 d）后，于給藥前30 min，外周靜脈采血，測(cè)定谷濃度。本院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)通過本試驗(yàn)方案。根據(jù)《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》（2015 年版）制定臨床療效和微生物學(xué)療效的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。臨床療效：評(píng)定為治愈的標(biāo)準(zhǔn)為癥狀、體征均已消失或完全恢復(fù)正常，且非微生物學(xué)指標(biāo)如影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室等均已恢復(fù)正常；微生物學(xué)療效：微生物清除或未清除但臨床癥狀及體征好轉(zhuǎn)評(píng)定為好轉(zhuǎn)?？傆行?（臨床治愈+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100%。

3.3 結(jié)果

參考相關(guān)文獻(xiàn)［8-9］，本研究將比阿培南谷濃度目標(biāo)設(shè)定為1～10 μg/mL，測(cè)定結(jié)果見圖2。低于最低檢測(cè)限的患者有5 例；有16 例低于1 μg/mL，根據(jù)《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》（2015 年版）制定的臨床療效和微生物學(xué)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，其中有13例治療效果不佳，調(diào)整比阿培南用藥方案比如加大單次使用劑量為0.6 g、增加給藥頻次至4 次/日、延長(zhǎng)泵注時(shí)間等，再次監(jiān)測(cè)谷濃度均有明顯上升，均在1～10 μg/mL范圍內(nèi)，最終有12例臨床治療有效，1 例患者死亡；46 例在目標(biāo)范圍（1～10 μg/mL）內(nèi)，臨床治療有效率為86.96%；有7 例大于10 μg/mL，其中2 例治療無效。

圖2 比阿培南血清游離谷濃度（實(shí)線表示為目標(biāo)濃度范圍1～10 mg/L）

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

比阿培南的水溶性大，在反相色譜柱上，特別是在非極性的C18 色譜柱上保留非常弱。在前期試驗(yàn)中為了獲得適當(dāng)?shù)纳V保留，使用乙腈-0.01 mol/L醋酸銨緩沖液（pH4.6）（2∶98）為流動(dòng)相，因采用的C18 色譜柱不是耐水色譜柱，高水比例的流動(dòng)相引起色譜柱硅膠基質(zhì)發(fā)生降解、修飾碳鏈倒伏斷裂，導(dǎo)致C18 色譜柱柱效快速下降、色譜峰型變差或拖尾等。因此，本研究換用了對(duì)極性大的化合物保留能力強(qiáng)、在水流動(dòng)相中性能穩(wěn)定的Waters Atlantis T3色譜柱，解決了普通C18 色譜柱難以保留極性化合物這種難題。

4.2 樣品處理方法的選擇

目前關(guān)于比阿培南血清濃度測(cè)定方法包括微生物效價(jià)法［10］、硫酸鋅或硫酸銨蛋白沉淀法［6,8,10］、沉淀蛋白后反洗法［11］、超濾離心法［6-7］、固相萃取法［12］等，但考慮到微生物效價(jià)法干擾因素較多，準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性較差，而固相萃取法因操作步驟繁瑣，且衍生化試劑和衍生化產(chǎn)物的不穩(wěn)定性易影響到測(cè)定結(jié)果，兩種方法均無法快速有效監(jiān)測(cè)比阿培南血清濃度。本研究選擇并比較了硫酸鋅蛋白沉淀法和超濾離心法對(duì)血樣分離效果的影響。經(jīng)硫酸鋅沉淀蛋白后的樣品，雖然處理過程簡(jiǎn)便、成本低，但可能是因?yàn)榱蛩徜\與比阿培南產(chǎn)生共沉淀，或者比阿培南濃度因硫酸鋅稀釋血樣后有所下降［5］，比阿培南提取回收率僅33%左右，樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過并靜置后仍變得渾濁不清，易堵塞色譜柱，色譜圖雜質(zhì)峰較多，干擾比阿培南峰，這結(jié)果與多篇文獻(xiàn)［6,8,10］報(bào)道不同。而超濾離心管處理的血樣提取回收率＞95%，能較好地保持比阿培南分子在血清中的活性，樣品澄清無雜質(zhì)，經(jīng)過約10 min 的處理就可快速用于測(cè)定，適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血清濃度，也可減少比阿培南因其不穩(wěn)定性導(dǎo)致的降解，是目前較好的血樣處理方法。比阿培南的蛋白結(jié)合率約10%，與蛋白結(jié)合的比阿培南分子量超過超濾離心管膜孔的截止尺寸（10 kD），將不能被濾過。超濾離心法具有簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，可作為測(cè)定比阿培南游離濃度的首選方法。

4.3 比阿培南血清游離濃度監(jiān)測(cè)

本研究測(cè)定的比阿培南血清游離濃度波動(dòng)范圍為0～24.32 μg/mL，說明比阿培南在體內(nèi)代謝過程個(gè)體化差異較大，這可能是因?yàn)榕c健康人群相比較，比阿培南在ICU 患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有很大差異，如Cmax（峰濃度）、AUC 0～8 h（0～8 h 內(nèi)的藥時(shí)-曲線下面積）小于健康人群，而T1/2（半衰期）、Cl（清除率）、Vd（表觀分布容積）遠(yuǎn)大于健康人群［4］，從而導(dǎo)致血藥濃度個(gè)體化差異較大。

在影響藥效達(dá)標(biāo)率（PTA）的諸多因素中如MIC（最低抑菌濃度）、Vd、T1/2 等，MIC 的權(quán)重最大，達(dá) 90%以上，且MIC 值與PTA 成反比［13］。比阿培南對(duì)敏感菌株、中介需氧菌和非產(chǎn)酶腸桿菌科等病原菌的清除率較高且細(xì)菌耐藥發(fā)生率較低；對(duì)ICU常見的耐藥菌如多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的MIC90 分別為32～64、16～64 mg/L，敏感率均＜30%［4,14］。

ICU 患者血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)個(gè)體差異大，病理生理狀態(tài)不同，本研究通過監(jiān)測(cè)比阿培南血清游離濃度，驗(yàn)證其是否在目標(biāo)范圍內(nèi)，并結(jié)合患者臨床癥狀及感染程度，制定比阿培南的個(gè)體化給藥方案，對(duì)大部分患者抗感染治療有一定的指導(dǎo)作用，能進(jìn)一步促進(jìn)臨床合理用藥，避免不良反應(yīng)的發(fā)生，提高臨床用藥安全性和有效性。