中藥中黃曲霉毒素檢測(cè)與脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

王燕，劉緒平，章紅，段和祥，劉衛(wèi)德，霍曉菲

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）為一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強(qiáng)、污染普遍，被列為Ⅰ級(jí)致癌物。研究表明，AFT 具有嚴(yán)重的肝毒性，甚至產(chǎn)生致畸、致癌和致突變等危害［1］。然而，中藥在種植、采收、炮制加工、貯藏等各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)AFT 污染，影響中藥質(zhì)量和臨床用藥安全［2］。近年來(lái)，中藥的質(zhì)量安全特別是中藥中AFT 污染問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國(guó)中藥現(xiàn)代化發(fā)展進(jìn)程。因此，中藥中AFT 檢測(cè)及降解脫毒技術(shù)的研究迫在眉睫。本文在簡(jiǎn)要介紹中藥中AFT 污染狀況基礎(chǔ)上，對(duì)AFT 國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)、AFT 檢測(cè)技術(shù)及降解脫毒技術(shù)進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為解決AFT 污染問(wèn)題，保障中藥質(zhì)量提供思路。

1 黃曲霉毒素的污染與限量

中藥污染AFT 與其自身基質(zhì)和外部環(huán)境之間有著密切的關(guān)系。污染的方式復(fù)雜多樣，可能發(fā)生在整個(gè)鏈條上，從鮮品到最終產(chǎn)品。從內(nèi)部因素來(lái)看，某些中藥基質(zhì)為霉菌生長(zhǎng)代謝提供充足營(yíng)養(yǎng)，從而加劇AFT 污染程度，如脂肪油、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分。其中脂肪油含量高的中藥最易受AFT 污染，其次則是富含糖類(lèi)和蛋白質(zhì)的中藥［3］。然而富含揮發(fā)油的藥材被證實(shí)具有抑制霉菌生長(zhǎng)的作用，與其他中藥材混合儲(chǔ)存，可以提高其他中藥的防霉能力，為中藥防霉技術(shù)提供了新思路。從外部因素來(lái)看，光照、溫度、水活度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、pH 值、氧化脅迫等環(huán)境因子都會(huì)對(duì)AFT 的合成產(chǎn)生影響［4］。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)AFT 的不斷深入研究，為維護(hù)公眾健康，保障用藥安全，各國(guó)對(duì)中藥中AFT進(jìn)行了限量規(guī)定（表1）。

表1 各國(guó)藥典對(duì)中藥中的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn) μg/kg

2 黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)

目前，儀器分析法和免疫學(xué)分析法是常用的AFT 檢測(cè)技術(shù)。儀器分析法包含高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和表面增強(qiáng)拉曼散射法等，免疫學(xué)分析法有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析技術(shù)和熒光免疫法等。然而，儀器分析法的樣品前處理繁瑣，儀器成本昂貴，且需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，難以滿(mǎn)足即時(shí)檢測(cè)要求；免疫分析法耗時(shí)耗財(cái)，且操作過(guò)程難以自動(dòng)化。近年來(lái)，隨著科技的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，膠體金免疫層析法、免疫芯片、免疫傳感器等大批新檢測(cè)技術(shù)層出不窮，這些新技術(shù)極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)在即時(shí)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)可視化等方面的短板，為中藥中AFT 現(xiàn)場(chǎng)快速可視化等檢測(cè)技術(shù)提供了有力支持。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是一種傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法，為最早應(yīng)用于測(cè)定AFT 的經(jīng)典方法之一。其原理是基于AFT 在紫外燈照射下具有熒光性，從而進(jìn)行定性定量分析。此技術(shù)操作簡(jiǎn)便，成本低廉，但其前處理復(fù)雜，特異性差，靈敏度低，檢測(cè)耗時(shí)，不能滿(mǎn)足當(dāng)下檢測(cè)分析要求。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有較高的檢測(cè)分離多種真菌毒素效能，成為檢測(cè)AFT 常用的方法之一。該技術(shù)原理是采用色譜柱分離技術(shù)，根據(jù)待測(cè)物分離的不同實(shí)際情況，通過(guò)測(cè)量色譜峰面積進(jìn)行AFT 定量分析［6］。HPLC 法有多種衍生化方法，如柱前衍生、柱后光化學(xué)衍生及柱后碘衍生等。其中，柱后光化學(xué)衍生法的應(yīng)用較為廣泛。由于其不需添加衍生化試劑，可通過(guò)在線(xiàn)紫外線(xiàn)照射將無(wú)熒光性的AFB1和AFG1羥基化，使其具有熒光性，提高靈敏度，且不影響其他組分，進(jìn)而可通過(guò)熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)4 種AFT 成分。例如，王云霞等［7］采用HPLC-柱后光化學(xué)衍生法檢測(cè)清火片（膠囊）中黃曲霉素G2、G1、B2、B1。該衍生化法還廣泛應(yīng)用于眾多的動(dòng)植物藥材中，如蓮子、柏子仁等［8-9］。HPLC-柱后碘衍生法在檢測(cè)中藥材中AFT 也有應(yīng)用，如陳皮、三七粉等［10-11］。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）將液相色譜與質(zhì)譜有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)［12］，能快速、準(zhǔn)確地定性定量分析藥材中痕量的AFT。羅朝權(quán)等［13］建立了一種即時(shí)檢測(cè)動(dòng)物類(lèi)藥材污染AFB1和AFG1的液質(zhì)聯(lián)用法，應(yīng)用該法檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，土鱉蟲(chóng)等動(dòng)物類(lèi)藥材受到黃曲霉菌嚴(yán)重污染。此外，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，研究者們從凈化方式和聯(lián)用儀器等方面入手，提出了更多優(yōu)化方案，如劉震營(yíng)等［14］采用IAC-HPLC-ESI-MS/MS 法測(cè)定柏子仁中的AFT。

2.4 免疫檢測(cè)技術(shù)

免疫檢測(cè)技術(shù)是抗原與抗體高度特異性識(shí)別的檢測(cè)方法［15］，綠色無(wú)污染，在AFT 檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。以下歸納總結(jié)了中藥常用的AFT 免疫檢測(cè)技術(shù)。

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）應(yīng)用抗原抗體的特異性反應(yīng)和酶的高度專(zhuān)一性、高效催化作用，進(jìn)而測(cè)定AFT 含量。該法可批量即時(shí)檢測(cè)樣本中的AFT，但在實(shí)際檢測(cè)中，很容易受到重金屬離子、脂肪及pH 等因素的干擾，可能會(huì)出現(xiàn)假陰/陽(yáng)性結(jié)果，樣品中的氧化酶、蛋白酶自身具有不穩(wěn)定性，試劑保質(zhì)期短，這也可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。劉蕊等［16］建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法快速檢測(cè)酸棗仁、柏子仁等6 味中藥材的AFs，并采用HPLC 法進(jìn)行結(jié)果確證，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致，可用于快速檢測(cè)AFs。

2.4.2 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)（GICT）是一種固相膜免疫分析方法，它將膠體金免疫技術(shù)與色譜層析技術(shù)相結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，結(jié)果判斷直觀(guān)可靠，無(wú)需大型儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，適用于抽樣現(xiàn)場(chǎng)快速篩查［17］。但GICT 制備抗體成本昂貴，樣品提取效率較低，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，需要進(jìn)一步優(yōu)化。李細(xì)芬等［18］采用GICT 檢測(cè)酸棗仁等6 味中藥材中AFB1含量，其結(jié)果與ELISA 法測(cè)定結(jié)果一致，所檢測(cè)中藥飲片中AFB1含量均符合要求。

2.4.3 熒光免疫分析法 熒光免疫分析（FIA）結(jié)合了高靈敏度的熒光技術(shù)和高特異性的免疫學(xué)反應(yīng)。其原理是利用待測(cè)物在反應(yīng)體系中特定結(jié)合位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)定性或定量分析獲得檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)熒光標(biāo)記材料的不同，可分為時(shí)間分辨熒光免疫分析法、熒光偏振免疫分析法和熒光激發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析法等［19］。該技術(shù)易實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)，但抗體成本昂貴，儀器不便攜，不適合現(xiàn)場(chǎng)篩查。余宇燕等［20］建立了一種快速靈敏的直接競(jìng)爭(zhēng)FIA 用于檢測(cè)陳皮、胖大海等5 味中藥中AFB1含量。結(jié)果表明，AFB1-FITC 標(biāo)記抗體的結(jié)合比率為4.19，可用于中藥中AFB1的分析測(cè)定。

2.4.4 化學(xué)發(fā)光免疫法 化學(xué)發(fā)光免疫法（CLIA）采用化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)待測(cè)物的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)確定其含量。根據(jù)標(biāo)記物的不同，可分為化學(xué)發(fā)光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。該技術(shù)無(wú)輻射、靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、方法快速穩(wěn)定、自動(dòng)化程度高，標(biāo)記物有效期長(zhǎng)且穩(wěn)定性好，但成本相對(duì)昂貴。吳震等［21］利用生物素親和及抗原與抗體免疫反應(yīng)，建立了一種基于光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測(cè)技術(shù)的AFB1檢測(cè)方法。

2.4.5 免疫傳感器 免疫傳感器由生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件組成，結(jié)合了免疫檢測(cè)技術(shù)和生物傳感器技術(shù)。根據(jù)傳導(dǎo)信號(hào)的不同，可分為光學(xué)免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器和壓電晶體免疫傳感器等［22］。該技術(shù)是一種具有廣泛發(fā)展前景的新型檢測(cè)技術(shù)，其自動(dòng)化程度高，不受樣品顏色、濁度的影響，可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素［23］。Wu 等［24］采用以T7 核酸外切酶、脫氧核糖核酸為模板的銀納米簇，建立了用于檢測(cè)AFB1的銀納米簇?zé)晒馍飩鞲衅?，該方法檢測(cè)限可達(dá)0.89 pg/mL。

2.4.6 免疫芯片 免疫芯片是生命科學(xué)與微電子學(xué)等學(xué)科交叉發(fā)展而形成的新興前沿技術(shù)。基本技術(shù)環(huán)節(jié)包括芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)與分析。根據(jù)其探針的不同，可分為基因芯片和蛋白芯片。該技術(shù)可進(jìn)行多參數(shù)同步分析，但其還處于開(kāi)發(fā)初期，點(diǎn)樣器成本昂貴，且樣品極易發(fā)生交叉反應(yīng)，因此免疫芯片的應(yīng)用范圍受限，還需深入研究［25］。

2.5 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）法是一種新型的快速檢測(cè)技術(shù)，其原理是樣品吸附在貴金屬粗糙表面時(shí)，拉曼光譜信號(hào)受表面等離子共振而增強(qiáng)。在對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，具有樣品非接觸、不破壞的特點(diǎn)［26］，同時(shí)可增強(qiáng)拉曼信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)極限的提高。該技術(shù)分辨率高、快速無(wú)損、設(shè)備攜帶方便，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥［27］、食品安全［28］等諸多領(lǐng)域。然而，具有較強(qiáng)SERS 效應(yīng)的貴金屬種類(lèi)極少，很難制備出重現(xiàn)性好、靈敏度高的基底，并且貴金屬增加了檢測(cè)成本，難以商業(yè)化?；诿庖叻ǖ腟ERS 傳感器可以在芯片上獨(dú)立檢測(cè)3 種真菌毒素［29］。在納米溶膠由濕態(tài)向干態(tài)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)SERS采集的技術(shù)稱(chēng)為動(dòng)態(tài)SERS（D-SERS），相較于常規(guī)SERS 信號(hào)，增加了2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)?；诖?，任菲等［30］采用D-SERS 對(duì)薏苡仁中的AFG1進(jìn)行檢測(cè)。該方法采用擦拭法提取樣品表面的AFG1，以AuNP作為SERS 的增強(qiáng)基底進(jìn)行D-SERS 分析，其檢測(cè)限達(dá)到5.5 μg/kg。

3 黃曲霉毒素降解脫毒技術(shù)

目前，降解AFT 常用的脫毒技術(shù)有物理法、化學(xué)法和生物技術(shù)法。

3.1 物理法

物理降解脫毒技術(shù)是利用光、熱、輻射等方式破壞AFT 的毒性，主要有高溫加熱法、吸附法、輻射法和溶劑萃取法等。

3.1.1 高溫加熱法 高溫加熱可破壞大部分毒素，但AFT 的降解溫度高（280 ℃左右），并且高溫加熱同時(shí)也可能會(huì)破壞中藥材基質(zhì)結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)、氨基酸等。因此高溫降解AFT 實(shí)際操作過(guò)程中存在較大困難，且能源消耗大，一般不宜采用。

3.1.2 吸附劑吸附法 吸附劑一般有活性炭、蒙脫石、沸石粉等。Martinez 等［31］研究表明活性炭能夠有效吸附赭曲霉素和AFT，真菌濃度在所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象中均下降。此法可吸附大部分毒素，成本低廉，但目前沒(méi)有最高效的吸附劑，有待進(jìn)一步研究。

3.1.3 輻射法 常用的輻射有γ 射線(xiàn)、紫外線(xiàn)、紅外線(xiàn)、電子束等。其中，γ 射線(xiàn)照射和紫外線(xiàn)技術(shù)的降毒效果顯著［32］。Nurtjahja 等［33］研究表明，肉豆蔻中黃曲霉菌種群總數(shù)及菌株活力隨 γ 輻射劑量增加而下降。此外，Patras 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，紫外線(xiàn)照射可顯著降低純水中的AFT（P＜0.05），并且增加紫外線(xiàn)劑量可降低細(xì)胞中AFT 引起的細(xì)胞毒性。但輻照耗能高，會(huì)對(duì)操作人員帶來(lái)潛在身體傷害，因此實(shí)際應(yīng)用中受阻。

3.1.4 溶劑萃取法 萃取溶劑有乙醇、乙腈-水、水溶性丙酮等溶液。陳建茹等［35］研究對(duì)比了75%乙醇與水對(duì)柏子仁中AFT 的脫毒效果，結(jié)果表明，75%乙醇更佳，但仍無(wú)法達(dá)到完全脫毒，且脫毒后的樣品可能仍不符合法定限量標(biāo)準(zhǔn)。該法既無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生，也不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但要求精確的樣品和溶劑的比例，萃取溶劑成本高且廢液處理繁瑣，因此在一定程度上限制了其應(yīng)用。

3.2 化學(xué)法

化學(xué)法是指采用化學(xué)試劑處理與生物毒素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而降低或消除其毒性。傳統(tǒng)化學(xué)試劑雖然能有效降解AFT，但同時(shí)可能存在化學(xué)殘留會(huì)污染環(huán)境或影響藥材化學(xué)成分。

3.2.1 堿處理法 羅小榮等［36］研究表明，1%碳酸氫銨溶液+2%～5%氨水清洗蓮子，AFT 下降趨勢(shì)明顯，去除率可達(dá)90%以上。此法操作難度低，成本低廉，是一種適合于工業(yè)化大生產(chǎn)的清洗方法。

3.2.2 氧化處理法 氧化劑通過(guò)氧化分解AFB1末端的呋喃環(huán)，從而降低毒性，常用的氧化試劑有ClO2、H2O2、O3、Cl2等。Yu 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，ClO2氣體可以抑制黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和產(chǎn)生AFB1。AFB1的降解率隨著ClO2濃度的增加而提高，而且AFB1的降解速度明顯加快。但該法同樣面臨化學(xué)殘留問(wèn)題而限制了其應(yīng)用。

3.2.3 天然精油法 天然精油可有效抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)和其毒素合成［38］。李紅玲，高微微［39］將揮發(fā)油直接混合于種子中、涂于表面、填充于包裝中，發(fā)現(xiàn)一定劑量的何首烏揮發(fā)油具有抑菌效果。天然精油提取自中藥，綠色無(wú)污染，且能夠充分利用藥材有效成分。這為藥對(duì)養(yǎng)護(hù)提供了新思路，將易霉變中藥與富含抗菌抑菌成分的藥材按照合理的比例混合貯藏，在一定程度上可以避免藥材霉變。但揮發(fā)油含量較低，成分復(fù)雜，使用難度大，成本昂貴。

3.3 生物法

生物脫毒法主要是利用微生物或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行脫毒，具有效率高、特異性強(qiáng)、綠色無(wú)污染的優(yōu)勢(shì)，且處理?xiàng)l件相對(duì)溫和，不會(huì)破壞藥材品質(zhì)，因此成為最近研究熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌及酵母菌等都具有降解AFT 能力［40］，該法包括生物酶解法、生物吸附法等［41］。

3.3.1 生物酶解法 生物酶解法是利用專(zhuān)一性和高效性的某些酶分解毒素分子的功能性基團(tuán)，將AFT 降解為低毒或無(wú)毒化合物。目前，酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物已經(jīng)被證實(shí)對(duì)黃曲霉菌具有顯著的抑制效果［42］。黃曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶等酶制劑也逐漸被用于AFT 的脫毒［41］。

3.3.2 生物吸附法 生物吸附法是利用微生物與AFT結(jié)合，形成菌體-AFT 復(fù)合體，達(dá)到脫毒目的。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌、乳酸菌和雙歧桿菌可通過(guò)細(xì)胞壁吸附作用去除AFT，其吸附能力與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)［43］。該法綠色環(huán)保，但吸附過(guò)程低效且可逆，并不能從本質(zhì)上脫去毒性，因此高效可行的生物吸附劑有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

中藥中AFT 污染問(wèn)題成為制約中藥國(guó)際化的關(guān)鍵因素之一。國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究從未停止過(guò)，但AFT 含量超標(biāo)事件仍經(jīng)常發(fā)生。因此，中藥中AFT 檢測(cè)及脫毒技術(shù)將成為當(dāng)前及今后的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的AFT 檢測(cè)技術(shù)中，儀器分析法具有靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果精確的優(yōu)點(diǎn)，但仍有待解決的問(wèn)題，如：樣本前處理復(fù)雜、對(duì)儀器及專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員要求高、難以滿(mǎn)足即時(shí)檢測(cè)等；免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷的特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。在未來(lái)研究中，開(kāi)發(fā)出更靈敏、更快速、更經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)成為新的趨勢(shì)和挑戰(zhàn)。在AFT 降解脫毒技術(shù)研究領(lǐng)域，與傳統(tǒng)的物理或化學(xué)降解方法相比，生物降解技術(shù)去除AFT 具有安全、高效、環(huán)保、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)研究AFT 防治的發(fā)展方向。因此，只有確?，F(xiàn)有中藥中AFT 檢測(cè)和解毒技術(shù)與時(shí)俱進(jìn)，才能保障用藥安全有效，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化進(jìn)程。