苦參的主要成分及質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進(jìn)展

熊樂(lè)樂(lè)，張靜，鄧維

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

苦參是豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)、利尿功效。臨床被廣泛用于濕熱引起的病癥，如內(nèi)服可治療熱痢、便血、黃疸尿閉等，外用常用于皮膚病及婦科疾?。?］，藥用價(jià)值高、療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦參主要活性成分有生物堿類、黃酮類、三萜皂苷類、酚酸類等，其中苦參堿類和黃酮苷類是最主要的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗心律失常、利尿、調(diào)節(jié)免疫、保肝、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性，具有非常廣泛的藥用價(jià)值［1-2］。因此，對(duì)苦參進(jìn)行深入的化學(xué)成分分析，有助于闡釋發(fā)揮藥效的活性成分，并為新藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法常用于中藥等復(fù)雜成分的分析鑒定，如超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UHPLC-QTOF）和超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法（UHPLC-QE），該方法可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合靈敏度高、分辨率高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中多成分的高效分離分析，成為中藥復(fù)雜成分分析的主要方法之一［3］。質(zhì)譜分析不僅可以提供精確的分子量信息，還可以提供豐富的碎片離子信息，通過(guò)碎片離子的裂解途徑可推測(cè)化合物所含官能團(tuán)，進(jìn)而可推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)信息。本文旨在探討苦參的主要活性成分組成及質(zhì)譜裂解規(guī)律，為進(jìn)一步研究苦參的物質(zhì)組成基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 主要成分

1.1 生物堿類

生物堿是目前苦參中分離鑒定的主要化合物，苦參中鑒定的生物堿絕大部分屬于喹諾里西啶類，還包括少量的哌啶類。喹諾里西啶類生物堿按骨架結(jié)構(gòu)可細(xì)分為四種類型，即苦參堿型、金雀花堿型、臭豆堿型和羽扇豆堿，母核結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦參堿提取物具有抗炎、抗病原微生物、抗過(guò)敏、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性［2］，目前苦參中共分離鑒定了65 個(gè)生物堿化合物［1,4］，其中苦參堿型鑒定了41 個(gè)化合物，代表性化合物有苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐胺堿等；金雀花堿型共鑒定了6 個(gè)化合物，分別是金雀花堿、N-甲基金雀花堿、菱葉黃花堿、N-丁基金雀花堿、氧化氮甲基金雀花堿和kushenine；臭豆堿鑒定了8 個(gè)，分別是臭豆堿、贗靛葉堿、野決明堿、白羽扇豆堿、5，6-去氫白羽扇豆堿、5-羥基白羽扇豆堿、7-羥基白羽扇豆堿，氧化白羽扇豆堿；羽扇豆堿型鑒定了1 個(gè)，即羽扇豆堿；苦參堿二聚體發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)化合物，其他生物堿鑒定了3 個(gè)化合物。代表性生物堿信息詳見(jiàn)表1。

圖1 苦參中主要生物堿的母核結(jié)構(gòu)：A.苦參堿型；B.金雀花堿型；C.臭豆堿型；D.羽扇豆堿型

表1 苦參中主要生物堿的化合物信息

1.2 黃酮類

黃酮類也是苦參中的主要成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、抗糖尿病等多種活性［1］。目前苦參中共發(fā)現(xiàn)并鑒定了165 個(gè)黃酮類化合物。按結(jié)構(gòu)可分為11 類，主要為二氫黃酮類（55個(gè)）、異黃酮類（31 個(gè)）、黃酮醇類（18 個(gè)）和二氫黃酮醇類（18 個(gè)），此外，還包括15 個(gè)紫檀烷類、10 個(gè)查爾酮類、10 個(gè)黃酮二聚體、3 個(gè)黃酮類似物、2 個(gè)黃酮、2 個(gè)高異黃酮類和1 個(gè)二氫異黃酮類［1］?？鄥⒅兄饕狞S酮母核結(jié)構(gòu)如圖2 所示。二氫黃酮類是苦參中最主要的黃酮化合物，A 環(huán)和C 環(huán)中C5和C7 位置容易被甲氧基或羥基取代，C8 位置常被異戊烯基取代，C6 位置一般無(wú)取代基，與之相連的B 環(huán)上C2’、C4’和C5’易發(fā)生甲氧基或羥基取代，C4’還會(huì)產(chǎn)生含氧糖苷鍵取代。異黃酮類在C5位置易發(fā)生羥基取代，C7 位置易發(fā)生甲氧基或含氧糖苷鍵取代，C6 和C8 位置一般無(wú)取代基，B 環(huán)中C3’和C4’易發(fā)生將羥基或甲氧基取代。黃酮醇類C5 和C7 位置容易發(fā)生甲氧基或羥基取代，C3 位羥基易發(fā)生糖苷鍵取代，C 環(huán)中C4’易發(fā)生羥基取代。二氫黃酮醇C5 位置易發(fā)生甲氧基取代，C7 位置容易發(fā)生羥基取代，C8 位置常被異戊烯基取代，C 環(huán)中C2’易發(fā)生羥基或甲氧基取代，C4’易發(fā)生羥基取代。苦參中代表性黃酮化合物見(jiàn)表2。

圖2 苦參中主要黃酮的母核結(jié)構(gòu)：A.二氫黃酮類；B.異黃酮類；C.黃酮醇類；D.二氫黃酮醇類

表2 苦參中代表性黃酮的化合物信息

1.3 三萜及三萜皂苷類

萜類成分具有較強(qiáng)的藥理活性，通常具有抗癌、抗病毒、降血糖等多種活性，是中藥的提取物重要活性成分之一［28］?？鄥⒅心壳胺蛛x鑒定了10 個(gè)三萜類化合物，三萜類主要有羽扇豆醇、羽扇豆烯酮、β-香樹(shù)脂醇、軟木三萜酮，三萜皂苷類主要有大豆皂苷Ⅰ及槐黃酮苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，代表性結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

圖3 三萜類（A）與三萜皂苷類（B）代表性結(jié)構(gòu)式

1.4 二苯甲酰類

有研究表明二苯甲酰類化合物對(duì)人體羧酸酯酶具有潛在抑制作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體生物活性，也是有機(jī)合成的重要組成成分［29-30］?？鄥⒅刑崛〉搅?7 種二苯甲酰類化合物［1］，包括槐二苯甲苷A～F、槐二苯甲苷J(rèn)～L、槐葉皂苷A、B、G、H、I 等，代表性結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 二苯甲酰類代表性結(jié)構(gòu)式

1.5 其他成分

除了上述主要四大類成分，苦參中還分離鑒定了4 個(gè)苯丙素類［31］、10 個(gè)酚酸類［20］、4 個(gè)香豆素類、2 個(gè)苯醌類、4 個(gè)甾體類［1］等。

2 苦參生物堿類質(zhì)譜裂解規(guī)律

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物堿的結(jié)構(gòu)解析，趙琴琴等［10］采用HPLC 串聯(lián)多級(jí)質(zhì)譜法，對(duì)苦參中生物堿類成分進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜解析，總結(jié)了金雀花型、臭豆堿型生物堿的質(zhì)譜裂解特征，為完善苦參生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析提供參考。李曉娜等［32］采用了高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（HPLC-Q-Exactive MS），對(duì)苦參中化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定解析，初步鑒定了16 個(gè)生物堿化合物，33 個(gè)黃酮類化合物，其中12 個(gè)異戊二烯黃酮類和3 個(gè)生物堿類化合物在苦參中被首次鑒定出來(lái)。通過(guò)對(duì)已知生物堿和黃酮類成分的質(zhì)譜裂解特點(diǎn)進(jìn)行歸納和總結(jié)，可對(duì)未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，為新化合物的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。本文主要對(duì)苦參中生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行歸納總結(jié)，為生物堿的質(zhì)譜鑒定提供參考。

2.1 苦參堿型生物堿

苦參堿型生物堿包括非氧化苦參堿型和N-氧化苦參堿型，通常指非氧化苦參堿型，N-氧化苦參堿是在非氧化苦參堿的1 號(hào)N 原子氧化形成N →O鍵，兩者均易發(fā)生典型的C 環(huán)質(zhì)譜裂解［33-35］。非氧化苦參堿以苦參堿為例，其裂解途徑如圖5 所示［34］?？鄥A在正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜易生成［M+H］+峰，質(zhì)荷比m/z 249，母離子中性丟失一分子H2，產(chǎn)生［M+H-H2］+碎片離子，m/z 247，在此基礎(chǔ)上，C環(huán)N16-C17 和C7-C11 發(fā)生斷裂，產(chǎn)生豐度較強(qiáng)的m/z 148 和150 的特征碎片離子，m/z 148 通常為基峰。C環(huán)上C5-C17 鍵和C7-C11 鍵也會(huì)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生m/z 136 的碎片離子。N-氧化苦參堿與非氧化苦參堿的裂解途徑相似，C 環(huán)裂解也會(huì)產(chǎn)生m/z 148 和150 的特征碎片離子，但氧化苦參堿型由于N1 原子被氧化，易中性丟失H2O 或丟失羥基自由基離子，分別產(chǎn)生［M+H-H2O］+和［M+H-OH］+.離子，即對(duì)應(yīng)m/z 248 和m/z 247 碎片離子，為N-氧化苦參堿的個(gè)特征裂解碎片峰，氧化苦參堿的裂解途徑見(jiàn)圖6［33,35］。因此可通過(guò)判斷母離子是否產(chǎn)生失水離子或羥基自由基離子來(lái)區(qū)分氧化苦參堿型和非氧化苦參堿型。

圖5 苦參堿的質(zhì)譜裂解途徑Ⅰ

圖6 氧化苦參堿的質(zhì)譜裂解途徑Ⅰ

除了上述提出的典型C 環(huán)裂解途徑外，WU等［36］對(duì)苦參堿型生物堿的質(zhì)譜裂解提出了一種新的裂解方式，即四中心氫重排模式。以苦參堿為例，裂解途徑見(jiàn)圖7?？鄥A的［M+H］+離子，通過(guò)質(zhì)子傳遞，N1-C6 鍵斷開(kāi)，質(zhì)子傳遞至N1，又從N1 傳遞至C7 位H，最后C6 與C7 形成雙鍵，形成C6-N1-H-C7 四中心氫重拍，C2-N1-H-C3 也會(huì)產(chǎn)生四中心氫重拍，N1-C2 鍵斷開(kāi)，C2 與C3 形成雙鍵，最終形成A 環(huán)、B 環(huán)開(kāi)環(huán)的中間體離子。該中間體離子會(huì)中性丟失NH3、CH3NH2、C2H5NH2產(chǎn)生相應(yīng)的m/z 232、218、204 系列離子；以m/z 204 為母離子，中性丟失一分子CH2CH2，產(chǎn)生m/z 176 離子，繼續(xù)丟失一分子CO，產(chǎn)生m/z 148 離子；D 環(huán)開(kāi)環(huán)產(chǎn)生m/z 179 離子，繼續(xù)丟失CH2NH 分子，產(chǎn)生m/z 150 離子?？鄥A在兩種裂解途徑下均能產(chǎn)生m/z 150 和148 離子，但對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)卻不同，四中心氫重排的裂解模式下碎片離子更豐富，但僅有文獻(xiàn)WU 等［36］介紹了這種裂解途徑，其他文獻(xiàn)幾乎無(wú)報(bào)道，目前文獻(xiàn)中苦參堿均以C 環(huán)開(kāi)環(huán)裂解的模式為主。

圖7 苦參堿的質(zhì)譜裂解途徑Ⅱ

綜上，兩種裂解模式下均能產(chǎn)生m/z 150 和148 典型碎片離子，其特點(diǎn)是能穩(wěn)定出現(xiàn)且豐度高，因此可作為苦參堿型生物堿的特征鑒別離子。在質(zhì)譜鑒定中可通過(guò)設(shè)置特征產(chǎn)物離子監(jiān)測(cè)模式，特征性地篩選出苦參堿型生物堿［34］。

2.2 金雀花堿型生物堿

金雀花堿型生物堿在B 環(huán)和C 環(huán)易產(chǎn)生質(zhì)譜裂解，C 環(huán)裂解是典型的裂解途徑，金雀花堿和N-甲基金雀花堿的裂解途徑如圖所示（圖8-9）。金雀花堿C 環(huán)裂解在C7-C13 鍵和C9-C11 鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生m/z 148 的特征碎片離子，m/z 148 離子繼續(xù)中性丟失一分子CO，產(chǎn)生m/z 120 碎片離子；N-甲基金雀花堿C 環(huán)裂解產(chǎn)生146 碎片離子，B 環(huán)裂解發(fā)生在C6-C7 和C9-C10 鍵斷裂，產(chǎn)生m/z 108 的碎片離子［10］。m/z 148 和146 是金雀花堿型母核的典型碎片離子，可作為篩選出金雀花堿型生物堿的判斷依據(jù)。AB 環(huán)碎片到底是m/z 146 還是m/z 148離子，可能與N12 位的取代基有關(guān)。

圖8 金雀花堿的質(zhì)譜裂解途徑

圖9 N-甲基金雀花堿的質(zhì)譜裂解途徑

2.3 臭豆堿型生物堿成分

臭豆堿型生物堿裂解方式與金雀花堿有相同的裂解途徑，C 環(huán)易發(fā)生質(zhì)譜裂解。臭豆堿的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖10，C 環(huán)裂解，C7-C17 和C9-C11 鍵斷裂，產(chǎn)生m/z 148 的特征碎片離子，與金雀花堿型的裂解特征易混淆，但金雀花堿型骨架由A、B、C 三個(gè)六元環(huán)組成，臭豆堿在此基礎(chǔ)上還存在一個(gè)D 環(huán)六元環(huán)，C 環(huán)裂解導(dǎo)致D 環(huán)也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子，臭豆堿D 環(huán)無(wú)取代基，則會(huì)產(chǎn)生m/z 98 的D 環(huán)特征碎片離子，以m/z 98 離子為母離子，觸發(fā)三級(jí)質(zhì)譜，發(fā)生RDA 裂解，生成m/z 70 的碎片離子。若D 環(huán)有取代，則會(huì)根據(jù)取代基的不同產(chǎn)生系列碎片離子，以贗靛葉堿為例（見(jiàn)圖11），D 環(huán)C13 位發(fā)生-OH取代，易中性丟失一分子H2O，產(chǎn)生m/z 243 的碎片離子，繼續(xù)發(fā)生C 環(huán)裂解，產(chǎn)生m/z 96 的D 環(huán)碎片離子；此外，贗靛葉堿也會(huì)直接C 環(huán)裂解，產(chǎn)生m/z 146 碎片離子和m/z 114 的D 環(huán)碎片離子［10］。

圖10 臭豆堿的質(zhì)譜裂解途徑

圖11 贗靛葉堿的質(zhì)譜裂解途徑

綜上，臭豆堿型生物堿的裂解途徑會(huì)產(chǎn)生特征碎片離子m/z 148 或146，還會(huì)產(chǎn)生一系列對(duì)應(yīng)的D環(huán)碎片離子m/z 114、98、96、70 等偶數(shù)碎片離子，碎片離子較金雀花堿型更豐富。

3 結(jié)語(yǔ)

苦參作為臨床廣泛使用的藥用植物，富含生物堿、黃酮及三萜皂苷類等活性成分，其中生物堿類因其豐富的藥理活性受到廣泛研究。目前苦參中共發(fā)現(xiàn)了六十多種生物堿化合物，按骨架結(jié)構(gòu)可細(xì)分為苦參堿型、金雀花堿型、臭豆堿型和羽扇豆堿型?？鄥A型生物堿是最主要的骨架類型，在電噴霧解離條件下主要發(fā)生C 環(huán)裂解，產(chǎn)生m/z 150、148 的特征碎片離子；氧化苦參堿型質(zhì)譜裂解易中性丟失水分子或羥基自由基離子。此外，有研究顯示苦參堿型在誘導(dǎo)碰撞解離條件下會(huì)發(fā)生四中心氫重排導(dǎo)致A、B 環(huán)裂解，中性丟失氨、甲胺、乙胺分子產(chǎn)生豐富的碎片離子。金雀花堿型主要發(fā)生C 環(huán)裂解，C7-C13 鍵和C9-C11 鍵斷裂，產(chǎn)生m/z 148、146的特征AB 環(huán)碎片離子，金雀花堿母核結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，碎片離子相對(duì)較少。臭豆堿型生物堿質(zhì)譜裂解與金雀花堿型類似，C 環(huán)裂解發(fā)生在C7-C17 和C9-C11鍵，除了產(chǎn)生相同的m/z 148、146 的AB 環(huán)碎片離子，還會(huì)產(chǎn)生豐富的質(zhì)荷比為偶數(shù)的D 環(huán)碎片離子。羽扇豆堿型生物堿化合物種類較少，相應(yīng)的質(zhì)譜研究也較少。根據(jù)已報(bào)道的代表性化學(xué)成分，并結(jié)合現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)對(duì)苦參的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，為苦參的開(kāi)發(fā)利用提供參考。