白棟文,包曉瑋, ,曾蘭君,劉曉祿,李怡歆,孫嘉莉,金渭荃,江峻峰
(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司,新疆和田 848000)
管花肉蓯蓉((Schrenk)Wight)別名大蕓,主要寄生于檉柳屬植物根部,為列當(dāng)科肉蓯蓉屬,是一種中國傳統(tǒng)名貴中藥材。肉蓯蓉食藥兩用歷史悠久,目前也是經(jīng)國家衛(wèi)健委安全性評估并廣泛公開征求意見后公布的藥食同源物質(zhì)之一。管花肉蓯蓉的葉子為乳白色,花朵呈紫色穗狀,三角披針形,采收后需干燥,使其得以長期保存,干燥后肉蓯蓉是深褐色的,葉片呈鱗片狀,整體像紡錘體。肉蓯蓉主要廣泛分布于干旱型的沙漠草原地區(qū),在我國主要產(chǎn)區(qū)分布于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆等地,國外分布于撒哈拉沙漠、內(nèi)夫德沙漠等沙漠地帶。肉蓯蓉作為著名的滋補藥草,其性溫,味甘、咸,歸腎、大腸經(jīng),具有補腎壯陽、保肝、抗衰老、增強學(xué)習(xí)記憶、抵御骨質(zhì)疏松、促進(jìn)傷口愈合、保護缺血性心肌等眾多藥理作用,素有“沙漠人參”之美譽,在醫(yī)藥行業(yè)深受歡迎。隨著肉蓯蓉的市場需求越來越大,野生肉蓯蓉被濫采亂挖,導(dǎo)致野生資源嚴(yán)重匱乏,野生肉蓯蓉已成為我國二級保護物種,但保健食品所使用的管花肉蓯蓉已開始人工種植。
管花肉蓯蓉主要的活性成分是苯乙醇苷類物質(zhì),苯乙醇苷中的兩種活性成分松果菊苷(Ech-Gs)和毛蕊花糖苷(Act-Gs)被認(rèn)為是構(gòu)成管花肉蓯蓉提取物的主要物質(zhì)。本實驗所使用的管花肉蓯蓉提取物通過使用高效液相色譜法測得Ech-Gs 含量為236 mg/g,Act-Gs 含量為12.7 mg/g。其中松果菊苷是文獻(xiàn)記載的首個苯乙醇苷類化合物,從狹葉紫錐中分離純化得到。許多研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉多糖具有抗衰老、抗氧化等功效,并且對用于D-半乳糖誘導(dǎo)致衰老模型小鼠來說具有明顯抗疲勞作用。Peng 等研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷可以通過激活過氧化物酶增殖物激活受體信號,發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用。玄國東等對小鼠連續(xù)4 周灌胃鹽生肉蓯蓉中提取出來的苯乙醇苷類物質(zhì)后發(fā)現(xiàn),苯乙醇苷類物質(zhì)不僅可以改善模型小鼠的大腦學(xué)習(xí)力和記憶反應(yīng)能力并且其具有明顯抗氧化作用??寡趸瘎┩ǔW鳛榭顾ダ蟿驗樗鼈兙哂星宄杂苫哪芰?。由于長期使用合成抗氧化劑會產(chǎn)生副作用,因此開發(fā)天然植物抗氧化劑顯得尤為重要。目前對于肉蓯蓉抗衰老的研究主要集中在植物多糖的作用研究上,對于苯乙醇苷類的作用研究較少,故本研究采用由苯乙醇苷類物質(zhì)構(gòu)成的管花肉蓯蓉提取物灌胃經(jīng)D-半乳糖皮下注射誘導(dǎo)的衰老模型小鼠,計算肝臟、腦組織的臟器指數(shù),測定肝臟、腦組織勻漿及血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量,并同時結(jié)合肝臟和腦組織病理切片,評價利用管花肉蓯蓉提取物對處于衰老狀態(tài)模型中的小鼠體內(nèi)抗氧化作用能力。本研究所得結(jié)果為開發(fā)利用管花肉蓯蓉提取物作為天然的植物抗氧化劑并在人體抗衰老過程中的重要作用研究提供重要理論依據(jù)。
管花肉蓯蓉提取物(供試品) 和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司提供,主要活性成分含量為Ech-Gs 236 mg/g,Act-Gs 12.7 mg/g;D-半乳糖 上海國藥試劑集團;維生素C 陜西頤生堂藥業(yè)有限公司;KM小鼠 雄性,5 周齡,體重23~26 g,購買于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(批號:SCXK(new)2018003),清潔級;超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS 號:82854-37-3)、毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS 號:61276-17-3) 成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司。
MSA125P-0CE-DU 精密分析天平 德國賽多利斯實驗儀器有限公司;IVC-II 獨立送風(fēng)隔離籠具北京佳源興業(yè)科技有限公司;TD-4M 低速臺式離心機 濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司;AE-31 數(shù)碼倒置顯微鏡 麥克奧迪公司;普析-T6 紫外可見分光光度計 北京普析通用有限公司;xMarkTM 酶標(biāo)儀
伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;Agilent-1260 安捷倫液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。
1.2.1 標(biāo)曲制作 按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,松果菊苷和毛蕊花糖苷線性回歸方程分別為Y=44.505X+221.1(=0.999)、Y=19.483X-9.3831(=0.9992)。
1.2.2 色譜條件 色譜柱:TC-C柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相:甲醇-水溶液(35:65,v/v)等度洗脫,流速1 mL/min,檢測波長334 nm,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫30 ℃。
1.2.3 動物分組與樣品采集處理 將78 只健康KM雄性小鼠隨機分為6 組,每組13 只,分別為空白組、模型組、V陽性組、管花肉蓯蓉提取物低劑量組(1 mg/10 g)、管花肉蓯蓉提取物中劑量(2 mg/10 g)以及管花肉蓯蓉提取物高劑量組(4 mg/10 g)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后,空白組每天頸部皮下注射生理鹽水(0.2 mL/10 g),給藥組和模型組每天頸部皮下注射D-半乳糖(1.20 mg/10 g)。空白組和模型組小鼠每天灌胃生理鹽水(0.1 mL/10 g),陽性組灌胃V(1.70 mg/10 g),管花肉蓯蓉提取物低、中、高劑量組每日灌胃管花肉蓯蓉提取物,連續(xù)每日灌胃30 d,有效灌胃劑量通過預(yù)實驗確定。
1.2.4 測定臟器指數(shù) 末次給藥后的小鼠均停止飲食24 h。取出各組小鼠的肝、腦組織,用低溫的生理鹽水清洗干凈臟器組織,用吸水紙將水份吸干凈之后稱取臟器組織重量。
1.2.5 小鼠肝組織、腦組織及血清T-SOD、GSH-Px活力及MDA 含量測定 用冰冷后的生理鹽水制備10%的肝、腦勻漿2 mL,制備后的勻漿于3000 r/min低溫離心10 min,取上清。眼眶靜脈叢采集小鼠血液,4 ℃冰箱靜置2 h,3000 r/min 低溫離心10 min,取上清。按照試劑盒操作測定小鼠肝、腦組織勻漿液及血清超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力及丙二醛(MDA)含量。
1.2.6 病理切片的制作 分別取出各組動物的肝、腦組織,然后將各組織于10 %的甲醛中固定,用生理鹽水反復(fù)沖洗4 次后進(jìn)行脫水和包埋;修塊、切片之后進(jìn)行粘片和粘片,二甲苯脫蠟20 min 后HE 染色并觀察組織切片。
圖1 及圖2 分別為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜和管花肉蓯蓉提取物圖譜。使用高效液相色譜法測得Ech-Gs 含量為236±2.78 mg/g,Act-Gs 含量為12.7±0.57 mg/g。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.1 Standard product map
圖2 管花肉蓯蓉提取物HPLCFig.2 HPLC of Cistanche deserticola extract
由圖3 可知,灌胃后30 d 內(nèi),各組小鼠體重均以快速上升的趨勢持續(xù)增長。在12 d 后,各組小鼠體重均高于模型組,該趨勢一直持續(xù)到30 d;在12~18 d期間,低劑量組小鼠體重與模型組小鼠體重保持接近,其余各組小鼠體重均高于模型組;在18~30 d 期間,中劑量組體重略低于空白組,但明顯高于其余各組,低劑量組與陽性組體重基本保持接近。從各組小鼠體重增長趨勢分析可以充分說明,隨著使用D-半乳糖衰老模型造模天數(shù)的增加,通過給衰老小鼠灌入不同濃度的管花肉蓯蓉提取物可以改善小鼠體重下降的情況。結(jié)果表明,管花肉蓯蓉提取物具有改善D-半乳糖致衰老小鼠體重下降的能力。
圖3 實驗小鼠30 d 內(nèi)體重變化Fig.3 Body weight changes of experimental mice within 30 d
由表1 可以看出,模型組與空白組相比,小鼠肝、腦臟器指數(shù)均極顯著下降(<0.01)。管花肉蓯蓉提取物低劑量組與模型組相比較,小鼠的肝、腦臟器指數(shù)均極顯著升高(<0.01);管花肉蓯蓉提取物中劑量組小鼠肝、腦臟器指數(shù)均極顯著升高(<0.01);管花肉蓯蓉提取物高劑量組小鼠肝組織臟器指數(shù)顯著升高(<0.05),腦臟器組織臟器指數(shù)極顯著升高(<0.01)。管花肉蓯蓉提取物中劑量組小鼠肝、腦臟器指數(shù)升高最為明顯,分別為模型組的1.62 和2.31 倍。臟器指數(shù)的變化情況可以反映出各器官的衰老變化情況,腦指數(shù)明顯降低則表明同齡動物感覺神經(jīng)和腦組織功能出現(xiàn)慢性萎縮,肝臟功能指數(shù)明顯降低則表明同齡動物的新陳代謝消化能力有所下降。管花肉蓯蓉提取物灌胃衰老小鼠后,對于衰老引起的腦組織慢性萎縮有明顯的緩解治療作用??傮w而言,管花肉蓯蓉提取物中劑量組具有明顯的延緩衰老及對小鼠大腦臟器功能退化的治療作用。
表1 管花肉蓯蓉提取物對衰老小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of Cistanche cistanche extract on the organ index of aging mice
2.4.1 GSH-Px 活力測定 通過表2 可以看出,模型組與空白組進(jìn)行比較,模型組動物的肝、腦組織中的GSH-Px 活力極顯著低于空白組(<0.01),血清中的GSH-Px 活力顯著低于空白組(<0.05),表明該組動物造模成功。V陽性組與模型組進(jìn)行比較,肝組織中GSH-Px 活性極顯著升高(<0.01),腦組織中GSH-Px 活性顯著升高(<0.05),血清中GSH-Px 活性無顯著差異(>0.05)。給藥組與模型組相比較,管花肉蓯蓉提取物低、高劑量組肝組織GSH-Px 活性極顯著升高(<0.01),中劑量組肝組織GSH-Px 活性顯著升高(<0.05);管花肉蓯蓉提取物中劑量組腦組織GSH-Px 活性極顯著升高(<0.01),低、高劑量組腦組織GSH-Px 活性無顯著差異(>0.05);管花肉蓯蓉提取物中、高劑量組血清中GSH-Px 活性極顯著升高(<0.01),低劑量組無顯著差異(>0.05)。管花肉蓯蓉提取物低劑量肝組織、中劑量腦組織、高劑量血清中GSH-Px 活性升高最為明顯分別為模型組的1.37、1.18、1.46 倍。
表2 管花肉蓯蓉提取物對小鼠肝、腦組織及血清中GSH-Px 活性的影響(,n=10)Table 2 Effects of Cistanche tubula extract on GSH-Px activity in mouse liver,brain tissue and serum (,n=10)
GSH-Px 通過一種特異性作用催化谷胱甘肽對二氧化氫的化學(xué)還原性和反應(yīng)作用來有效保護它的細(xì)胞膜。但隨著年齡的增長,體內(nèi)抗氧化酶水平降低,清除自由基的動態(tài)平衡被打亂,引起一系列的自由基反應(yīng),導(dǎo)致身體狀況異常。因此,抗氧化酶的活性不僅是直接衡量一個機體抗氧化能力強弱的重要指標(biāo),也是直接評估一個機體衰老程度的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果表明,管花肉蓯蓉提取物作用于衰老模型動物后,肝、腦組織及血清中GSH-Px 活性均提高,據(jù)此推測管花肉蓯蓉提取物能夠通過提高GSHPx 的活性,進(jìn)而延緩衰老。
2.4.2 SOD 活力測定 由表3 可知,模型組與空白組進(jìn)行比較,模型組動物肝組織勻漿SOD 活性顯著降低(<0.05),腦組織勻漿和血清中SOD 活性極顯著降低(<0.01),證明動物造模成功。V陽性組與模型組進(jìn)行比較,肝組織勻漿和血清SOD 活性顯著升高(<0.05),腦組織勻漿中SOD 活性極顯著升高(<0.01)。給藥組與模型組進(jìn)行比較,管花肉蓯蓉提取物中劑量組肝組織勻漿中SOD 活性顯著升高(<0.05),低、高劑量組肝組織勻漿中SOD 活性無顯著差異(>0.05);管花肉蓯蓉提取物低劑量組腦組織勻漿中SOD 活性顯著升高(<0.05),高劑量組腦組織勻漿中SOD 活性極顯著升高(<0.01),中劑量組腦組織勻漿中SOD 活性無顯著差異(>0.05);管花肉蓯蓉提取物低劑量組血清中SOD 活性顯著升高(<0.05),中劑量組血清中SOD 活性極顯著升高(<0.01),高劑量組血清中SOD 活性無顯著差異(>0.05)。管花肉蓯蓉提取物中劑量肝組織、高劑量腦組織、中劑量血清中SOD 活性升高最為明顯分別為模型組的1.11、1.14、1.74 倍。
表3 管花肉蓯蓉提取物對小鼠肝、腦組織及血清中SOD 活性的影響(,n=10)Table 3 Effects of Cistanche tubulosa extract on SOD activity in mouse liver and brain tissue and serum (,n=10)
抗氧化酶SOD 不僅是人體細(xì)胞清除自由基系統(tǒng)的重要成員,也是機體內(nèi)重要的一種抗氧化劑。SOD 也被認(rèn)為是人體清除ROS 的一個關(guān)鍵酶,在發(fā)揮維持機體氧化和抗氧化劑之間的平衡方面發(fā)揮著重要的主導(dǎo)作用。隨著整個機體的衰老,SOD 活性可能會逐漸降低,隨著其它抗氧化劑類物質(zhì)的攝入越來越少,自由基損傷因子(OFR-MDA)也隨之增加。大量研究結(jié)果表明,衰老模型動物組織中SOD 含量大幅降低,說明SOD 含量水平與動物機體衰老水平呈正相關(guān)。在灌胃一定劑量的管花肉蓯蓉提取物后,提高了衰老小鼠肝、腦組織及血清中SOD 的活性(<0.01),進(jìn)而起到延緩衰老的作用。
2.4.3 MDA 含量測定 由表4 可知,模型組與空白組進(jìn)行比較,模型組動物的肝、腦組織中的MDA 含量均極顯著增加(<0.01),血清中的MDA 含量顯著增加(<0.05),動物造模成功。V陽性組與模型組比較,肝、腦組織及血清中MDA 含量均極顯著降低(<0.01)。給藥組與模型組比較,管花肉蓯蓉提取物低、中、高劑量組肝組織中MDA 含量均極顯著降低(<0.01);管花肉蓯蓉提取物低劑量組腦組織中MDA含量顯著降低(<0.05);中、高劑量組腦組織中MDA含量極顯著降低(<0.01);管花肉蓯蓉提取物低、中、高劑量組血清中MDA 含量均極顯著降低(<0.01)。管花肉蓯蓉提取物中劑量肝組織、高劑量腦組織、中劑量血清中MDA 含量降低最為明顯分別比模型組減少23.86%、41.68%、38.30%。
表4 管花肉蓯蓉提取物對小鼠肝、腦組織及血清中MDA 含量的影響(,n=10)Table 4 Effects of Cistanche cistanche extract on the content of MDA in mouse liver and brain tissue and serum (,n=10)
MDA 是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物。MDA 的含量的高低可以直接反映體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化的程度。研究表明,老年人腦中MDA 的含量顯著升高,并且MDA 的含量隨著年齡的增長呈上升趨勢。因此,MDA 含量也是評估衰老程度的重要指標(biāo)。許多科學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn),無論是使用D-半乳糖反應(yīng)模型、臭氧損傷反應(yīng)模型、輻照反應(yīng)模型、還是快速細(xì)胞老化反應(yīng)模型,血清和組織細(xì)胞中的MDA 含量都會不斷增加導(dǎo)致組織內(nèi)各器官的損傷,進(jìn)而引起各種疾病。實驗結(jié)果分析表明,管花肉蓯蓉提取物作用于衰老模型后,小鼠肝、腦組織及血清中MDA含量出現(xiàn)極顯著降低(<0.01),實現(xiàn)了對衰老模型小鼠明顯有效的抗衰老作用。
由圖4 可以明顯看出,正常組中肝內(nèi)層細(xì)胞膜上的細(xì)胞體正常,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列形態(tài)有序。模型組的肝內(nèi)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列不均勻,多處細(xì)胞出現(xiàn)了肝細(xì)胞壞死、瘢痕組織已有增生、肝內(nèi)細(xì)胞明顯發(fā)生水腫、肝臟內(nèi)細(xì)胞膜已被破壞、細(xì)胞間瘢痕組織發(fā)生融合、竇腔完全消失。V陽性組的部分肝上皮細(xì)胞排列有序,部分肝細(xì)胞內(nèi)可能有良性水腫,包漿中可能有少量顆粒病變,竇腔較小,有分裂象、膽管增生,中央靜脈周圍細(xì)胞均正常。管花肉蓯蓉提取物低劑量組的中央靜脈,血管擴張,肝細(xì)胞代謝增強(細(xì)胞核大小不一),肝竇擴張充血,偶見細(xì)胞壞死。管花肉蓯蓉提取物中劑量組的部分中央肝靜脈周圍有少量肝細(xì)胞呈嗜酸性,肝竇輕度膨脹充血,竇腔間隙明顯,肝細(xì)胞膜形態(tài)完整。管花肉蓯蓉提取物高劑量組的中央靜脈周圍有壞死灶,局部區(qū)域肝細(xì)胞水腫,部分中央靜脈和匯管區(qū)靜脈膨脹充血,竇細(xì)胞增多。模型組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)異常,管花肉蓯蓉提取物低、高劑量組能夠改善衰老肝細(xì)胞,但是效果都沒有管花肉蓯蓉提取物中劑量組好。
圖4 小鼠肝組織切片 HE 染色結(jié)果(400×)Fig.4 HE staining results of mouse liver tissue sections (400×)
由圖5 可以明顯看出,正常組神經(jīng)元內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整,無彈性膠質(zhì)細(xì)胞聚集。模型組中腦神經(jīng)細(xì)胞大量發(fā)生壞死,神經(jīng)細(xì)胞核大量濃縮,突觸模糊,顆粒細(xì)胞出現(xiàn)水腫,結(jié)構(gòu)不完整。V陽性組的神經(jīng)元正常狀態(tài)良好。管花肉蓯蓉提取物低劑量組中顆粒細(xì)胞、邊緣細(xì)胞輕度水腫,部分細(xì)胞核輕度濃縮,腦組織相對疏松。管花肉蓯蓉提取物中劑量組的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯有所增多,突觸明顯,細(xì)胞核未濃縮。管花肉蓯蓉提取物高劑量組中顆粒細(xì)胞水腫,細(xì)胞核輕度濃縮。與管花肉蓯蓉提取物低、高劑量組和V陽性組比較,管花肉蓯蓉提取物中劑量組可明顯的改善腦細(xì)胞因衰老而引起的異常。
圖5 小鼠腦組織切片 HE 染色結(jié)果(400×)Fig.5 HE staining results of mouse brain tissue sections (400×)
衰老是世界萬物都會面臨的自然現(xiàn)象,也是機體各種生理變化的總稱。大量研究結(jié)果證明,長期大量注射D-半乳糖會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)迅速堆積大量自由基,降低體內(nèi)抗氧化酶活性,加速體內(nèi)脂質(zhì)過程的氧化,引起小鼠體內(nèi)抗氧化應(yīng)激,使小鼠出現(xiàn)多種衰老體征,包括壽命縮短、學(xué)習(xí)和記憶力障礙以及免疫力低下等。這種生化和組織結(jié)構(gòu)的改變與自然衰老表現(xiàn)大體一致。
本研究通過管花肉蓯蓉提取物灌胃經(jīng)D-半乳糖皮下注射誘導(dǎo)的衰老模型小鼠后發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉提取物中(2 mg/10 g)劑量可以有效的減弱衰老模型小鼠正常體重輕化的趨勢,管花肉蓯蓉提取物中、高(2、4 mg/10 g)劑量可以有效的提高衰老模型小鼠肝、腦組織的臟器指數(shù),管花肉蓯蓉提取物中、高(2、4 mg/10 g)劑量可以有效的增加衰老小鼠肝、腦組織及血清中SOD 和GSH-Px 活性,降低肝、腦組織及血清中MDA 含量,管花肉蓯蓉提取物中(2 mg/10 g)劑量使衰老小鼠的肝、腦組織的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)功能得到明顯改善。這些結(jié)果表明,管花肉蓯蓉提取物能夠有效的緩解和改善衰老。在管花肉蓯蓉提取物三種不同劑量中,中劑量的效果最為明顯。本研究通過HPLC 法測得管花肉蓯蓉提取物中有效成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷,許多研究證明松果菊苷和毛蕊花糖苷具有抗衰老的作用。張洪泉等檢測毛蕊花糖苷對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠的影響時發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷可以減少心臟、肝臟和腦組織的MDA 含量,端粒酶活性增加,淋巴細(xì)胞增殖能力增加,腹腔巨噬細(xì)胞的反應(yīng)和吞噬功能增加,表明毛蕊花糖苷可能是通過提高端粒酶活性,調(diào)節(jié)機體免疫功能而獲得延緩衰老的目的。Peng 等研究也指出毛蕊花糖苷對D-半乳糖和AlCl聯(lián)合誘導(dǎo)衰老模型小鼠的認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)能力有較好的緩解作用。Chen 等發(fā)現(xiàn)松果菊苷是延緩衰老的有效成分,可以通過多種信號通路延長秀麗隱桿線蟲的壽命。由此判斷可能是管花肉蓯蓉提取物中的松果菊苷和毛蕊花糖苷發(fā)揮了改善衰老的作用。但為何中劑量效果最為明顯有待進(jìn)一步深入研究和闡明。