蜂蜜中抗生素殘留的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

馬永強(qiáng)，張絲瑤，遇世友，王 鑫，黎晨晨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150028）

蜂蜜是蜜蜂從植物花蜜或蜜露中提取的一種可以應(yīng)用于食品、藥品或化妝品的天然產(chǎn)品。蜂蜜中除含有糖類物質(zhì)外，還富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、生物活性酶、氨基酸、維生素等。其不僅能夠起到調(diào)節(jié)機(jī)體生理機(jī)能、促進(jìn)消化、潤(rùn)腸通便等作用，還具有抗氧化性、抗菌性等多種藥理特性，對(duì)人體健康有諸多益處。隨著蜂產(chǎn)品逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，其質(zhì)量安全問題也得到了更多的重視。在養(yǎng)蜂過程中，蜜蜂若患有腐臭病或敗血病則會(huì)降低蜂蜜的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此，蜂農(nóng)經(jīng)常使用抗生素來預(yù)防和治療蜜蜂的疾病。

抗生素一般是指微生物或由高等動(dòng)物、植物在生理代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的一種具有抗病原體等生物活性的次級(jí)代謝物。養(yǎng)蜂業(yè)中常用的抗生素包括四環(huán)素類、喹諾酮類、硝基咪唑類、磺胺類、氯霉素等。由于抗生素在蜜蜂內(nèi)代謝不完全，使得在應(yīng)用抗生素治療蜜蜂疾病的同時(shí)，也會(huì)影響蜂蜜的食品安全質(zhì)量，并且會(huì)對(duì)人體造成過敏性反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性、菌群失調(diào)等危害。因此研究蜂蜜中抗生素殘留的快速、高效、靈敏的檢測(cè)方法具有重要的意義。

目前，色譜技術(shù)在檢測(cè)蜂蜜抗生素殘留方面應(yīng)用較多，色譜法具有檢測(cè)范圍廣、靈敏度高、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，但其儀器十分昂貴，檢測(cè)成本較高。為了提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本，近年來，在蜂蜜抗生素的殘留檢測(cè)領(lǐng)域，更多研究者關(guān)注于對(duì)高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的改進(jìn)，以及新型檢測(cè)方法的研發(fā)，例如傳感器法、免疫分析法等。本文介紹了蜂蜜中抗生素的殘留現(xiàn)狀及檢測(cè)方法，為蜂蜜中抗生素殘留的后續(xù)檢測(cè)研究提供理論參考。

1 蜂蜜中抗生素殘留現(xiàn)狀概述

1.1 四環(huán)素類

四環(huán)素類抗生素（Tetracyclines，TCs）是廣譜抗生素中應(yīng)用較多的一類，包含四環(huán)素、土霉素、金霉素等多個(gè)種類。它可以治療因革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、螺旋體、立克次體等引起的疾病。因其治療效果強(qiáng)、吸收好、毒性低、價(jià)格低廉，在養(yǎng)蜂過程中，蜂農(nóng)常用其治療蜜蜂幼蟲腐臭病。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了不同食品中土霉素、四環(huán)素、金霉素的最大殘留限量，其中肉為200 μg/kg，奶為100 μg/kg，蛋為400 μg/kg，而未對(duì)蜂蜜中四環(huán)素類有限量要求。有研究對(duì)2014～2020 年不同地區(qū)的近4 萬個(gè)蜂蜜樣品進(jìn)行抽檢，檢測(cè)結(jié)果表明蜂蜜中TCs 檢出率雖逐年下降，但仍存在TCs 可檢出的樣品。TCs 經(jīng)人體攝入后，殘留的藥物會(huì)沉積在骨骼及牙齒組織內(nèi)導(dǎo)致牙齒變黃，另外，TCs 會(huì)富集在肝臟中對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害，攝入量過大甚至?xí)?duì)食用者的生命安全造成威脅。因此，不僅需要加大對(duì)于蜂蜜中TCs 的檢測(cè)力度，還需要注重其檢測(cè)技術(shù)及檢出含量。

1.2 喹諾酮類

喹諾酮類抗生素（Quinolones，QNs）是一種被廣泛使用的合成廣譜抗生素，包括諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星等。它通過破壞拓?fù)洚悩?gòu)酶IV 和DNA 回旋酶來抑制細(xì)菌DNA 復(fù)制，從而快速殺滅厭氧菌、分枝桿菌等細(xì)菌。QNs 因具有良好的吸收效果及廣譜抗菌活性被應(yīng)用于蜜蜂疾病的治療。當(dāng)殘留在蜂蜜中的 QNs 被人體攝入后，對(duì)腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和肝腎等會(huì)產(chǎn)生危害及毒性。根據(jù)NY/T 5030-2016《無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則》規(guī)定，諾氟沙星、氧氟沙星為不得使用的藥物。但蜂蜜中喹諾酮類抗生素殘留檢出及超標(biāo)情況也時(shí)有發(fā)生，有研究對(duì)不同種類、不同品牌的50 種蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)，其中有3 種蜂蜜檢出諾氟沙星。2019 年廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行抽檢，結(jié)果顯示有5 個(gè)批次的蜂蜜均檢測(cè)出QNs 殘留。

1.3 硝基咪唑類

硝基咪唑類抗生素（Nitromidazoles，NMZs）是對(duì)分枝桿菌、厭氧菌等多種生物具備廣譜抗菌活性的硝基雜環(huán)化合物。硝基咪唑類抗生素具有致畸、致癌、致突變作用，根據(jù) GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》以及NY/T 5030-2016《無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則》可知，甲硝唑、地美硝唑允許做治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出。但仍有部分蜂農(nóng)為了預(yù)防和治療蜜蜂孢子蟲病和阿米巴蟲病違法使用甲硝唑、地美硝唑等硝基咪唑類物質(zhì)。有研究分別對(duì)江蘇省162 份蜂蜜樣品以及山東省170 份蜂蜜樣品中甲硝唑的殘留情況進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，結(jié)果表明，蜂蜜中仍然存在甲硝唑殘留的情況，檢出范圍分別達(dá)到1.15～18.80 μg/kg、N.D.～60.20 μg/kg。雖然NMZs 在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，但其代謝產(chǎn)物仍具有危害健康的潛能。若在食物中存在過多藥物殘留，不僅會(huì)造成食品安全隱患，還會(huì)危害人體自身健康。

1.4 磺胺類

磺胺類抗生素（sulfonamides，SAs）是相對(duì)穩(wěn)定的一類人工合成的廣譜抑菌劑，在蜜蜂養(yǎng)殖過程中可用于防治蜜蜂感染美國(guó)菌病、歐洲菌病等。例如磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶等物質(zhì)具有較強(qiáng)的毒性，若食用含有過量磺胺類抗生素的蜂蜜，會(huì)造成人體免疫力降低、影響骨髓造血功能、損害泌尿系統(tǒng)、損壞腎臟等危害。根據(jù)GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》可知，磺胺類物質(zhì)在蜂蜜中的最大殘留限量為100 ug/kg。有研究對(duì)浙江省125 批次的蜂蜜樣品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，其中有21 種蜂蜜樣品檢出磺胺類抗生素殘留，檢出率達(dá)1.6%。還有研究者通過其建立的高效液相色譜法對(duì)8 種蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中1 份蜂蜜樣品磺胺類抗生素殘留量達(dá)到1.03 mg/kg，說明目前存在SAs 超標(biāo)的問題。該類物質(zhì)在人體內(nèi)代謝進(jìn)程緩慢，如在蜂蜜中殘留過量，其帶來的毒理風(fēng)險(xiǎn)對(duì)蜂產(chǎn)品消費(fèi)者是一種潛在的危害。

1.5 氯霉素

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種具有優(yōu)良抑菌性能的廣譜抗生素，因其價(jià)格低廉且對(duì)治療動(dòng)物因革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性球菌而感染的疾病有良好的效果而被廣泛應(yīng)用。但由于CAP 對(duì)人體健康存在一定危害，長(zhǎng)期服用或者過量服用氯霉素會(huì)造成再生障礙性貧血、灰嬰綜合癥、粒狀白細(xì)胞缺乏等問題。2002 年歐盟在我國(guó)進(jìn)口的蜂蜜中檢出氯霉素并且暫停了中國(guó)出產(chǎn)的蜂蜜進(jìn)入到歐盟市場(chǎng)，雖然在2004 年歐盟解除了對(duì)中國(guó)蜂蜜進(jìn)口的禁令，但這一事件不僅對(duì)我國(guó)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重影響了我國(guó)蜂蜜行業(yè)的國(guó)際聲譽(yù)。自此我國(guó)加大了對(duì)蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)和監(jiān)察力度，2015～2018 年國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢了不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)企業(yè)的蜂蜜，在抽檢的2279 批次蜂蜜中，檢出不合格樣品為41 批次，其中氯霉素抽檢不合格達(dá)27 批次，其檢出范圍為0.20～2.08 μg/kg，根據(jù)NY/T 5030-2016《無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則》可知，氯霉素為食品動(dòng)物禁用及動(dòng)物性食品中不得檢出的獸藥，抽檢結(jié)果說明蜂蜜中CAP 超標(biāo)的現(xiàn)象仍然存在，對(duì)于其檢測(cè)監(jiān)察還要引起高度重視。

2 蜂蜜中抗生物殘留的檢測(cè)方法

2.1 色譜法

目前，國(guó)標(biāo)中對(duì)于蜂蜜殘留的四環(huán)素類、喹諾酮類、硝基咪唑類等抗生素均有色譜檢測(cè)方法，但每種國(guó)標(biāo)方法只針對(duì)于一類抗生素進(jìn)行檢測(cè)，研究者通過在國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，從而達(dá)到同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中多種抗生素殘留的目的。

2.1.1 高效液相色譜法 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）利用高壓輸液系統(tǒng)，使有機(jī)溶劑等液體流動(dòng)相通過裝置泵進(jìn)入帶有固定相的色譜柱當(dāng)中，待柱中的各成分分離出來，而后檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析。HPLC 檢測(cè)范圍較廣，靈敏度、檢出率均較高。

魏貞貞等通過在蜂蜜樣品中加入酸與甲醇溶液配成的萃取液提取抗生素，經(jīng)離心、過膜后再加入內(nèi)標(biāo)物，以甲醇和草酸為液體流動(dòng)相，采用C色譜柱進(jìn)行分離，通過帶有紫外二級(jí)陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明四環(huán)素、土霉素、甲硝唑三種抗生素的檢出限為0.07～0.08 μg/g，以10、20、50 μg/g 3 個(gè)添加水平做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其樣品回收率為82.4%～93.7%，RSD＜3.5%。此方法對(duì)于三種抗生素的回收率及分離效果均較好，但抗生素萃取液的pH 以及添加量都會(huì)對(duì)提取效果產(chǎn)生影響，并且該方法同時(shí)檢測(cè)的抗生素種類也相對(duì)較少。盧坤等以乙腈和磷酸水溶液為流動(dòng)相，通過PCX 固相萃取小柱對(duì)蜂蜜中抗生素進(jìn)行提取，通過C色譜柱及雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)模式對(duì)蜂蜜中15 種抗生素殘留進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。研究結(jié)果顯示在0.2～20.0 mg/L 范圍內(nèi)被檢測(cè)的15 種抗生素線性關(guān)系良好，檢出限為9.70～12.54 μg/kg，分別添加0.05、0.20、0.50 mg/kg 3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，樣品回收率可達(dá)60%～105%，RSD＜7.0%。利用固相萃取小柱可以代替步驟繁雜的液液萃取方法，并且在去除干擾物質(zhì)的同時(shí)對(duì)抗生素的提取效率也較高。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種抗生素進(jìn)行同時(shí)測(cè)定且分離能力較好，可適用于殘留抗生素種類繁多的樣品檢測(cè)中。

液相色譜的優(yōu)勢(shì)在于其高效的分離能力，但物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征難以確定，在樣品檢測(cè)中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。對(duì)于蜂蜜這種基質(zhì)復(fù)雜的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一般需要借助質(zhì)譜技術(shù)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性，從而更加有效地分析抗生素殘留情況。

2.1.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）是利用液相色譜對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離，再通過質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)合了色譜的高分離性能及質(zhì)譜的定性功能，將兩者的優(yōu)勢(shì)形成互補(bǔ)，進(jìn)而提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，液質(zhì)聯(lián)用法在很大程度上能夠降低檢測(cè)過程中的干擾因素，增強(qiáng)其分離能力，從而提高檢測(cè)的靈敏度。

張中印等以甲酸銨、甲酸復(fù)合溶液和甲醇作為流動(dòng)相，利用目前應(yīng)用較多的QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,and Safe）前處理方法，選用N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C）作為吸附劑對(duì)蜂蜜進(jìn)行處理，采用C色譜柱進(jìn)行分離，通過HPLC-MS/MS 對(duì)蜂蜜中14 種喹諾酮類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)于14 種抗生素的檢測(cè)均具有較高的選擇性，不同蜂蜜樣品中的抗生素平均基質(zhì)效應(yīng)在-75.0%～29.2%之間，且該方法不存在殘留效應(yīng)，其檢測(cè)限為0.45～2.58 ng/g，定量限（LOQ）為1.51～8.59 ng/g，分別以14 種抗生素的LOQ、3 倍LOQ及10 倍LOQ 為3 個(gè)水平添加量做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率可達(dá)81.2%～108.3%。蜂蜜的樣品前處理會(huì)影響檢測(cè)中的基質(zhì)效應(yīng)，從而會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定影響。QuEChERS 方法是近年來應(yīng)用較多的一種前處理技術(shù)，它具有價(jià)格低廉、處理快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，其一般選擇PSA 及C18 等傳統(tǒng)吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理，基于對(duì)QuEChERS 方法的改進(jìn)，Xu 等選擇氧化鋅（ZnO）作為蜂蜜樣品前處理的吸附劑來降低基質(zhì)帶來的干擾，利用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)蜂蜜樣品中林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類15 種抗生素的殘留。研究顯示，ZnO 比傳統(tǒng)吸附劑的吸附性能更好，檢測(cè)限為0.24～0.68 μg/kg，定量限為0.80～2.27 μg/kg，以5.0、10.0、20.0 μg/kg 3 個(gè)水平做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收率為81.3%～99.0%，RSD＜9.18%，并且將本實(shí)驗(yàn)的研究方法應(yīng)用到實(shí)際蜂蜜檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有林可霉素殘留。該方法利用氧化鋅這種新型吸附劑替代傳統(tǒng)吸附劑對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理，其對(duì)抗生素檢測(cè)限及精密度方面表現(xiàn)出更加良好的性能。在液質(zhì)聯(lián)用方法的基礎(chǔ)上，Baeza 等采用分子印跡聚合物（MISPE）與液質(zhì)法相結(jié)合的方式來識(shí)別和定量蜂蜜中6 種磺胺類抗生素，研究以磺胺喹惡啉為模板合成了磺胺類分子印跡聚合物，并將其裝入固相萃取空柱中，制備出磺胺類分子印跡固相萃取柱，通過其對(duì)蜂蜜中的抗生素進(jìn)行提取。以乙腈、甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用HR-ODS 色譜柱進(jìn)行分離，研究結(jié)果表明，在1、10、20 μg/kg 3 個(gè)添加水平下其加標(biāo)回收率在84.3%～104.7%之間，檢測(cè)限可達(dá)0.1～4.2 μg/kg，定量限為0.2～4.4 μg/kg，RSD＜11.6%。傳統(tǒng)的固相萃取柱一般以硅膠等為填料，對(duì)目標(biāo)抗生素?zé)o法進(jìn)行特異性識(shí)別，而此方法的分子印跡聚合物能夠有選擇性的識(shí)別目標(biāo)抗生素，其檢測(cè)限較低，準(zhǔn)確度及精密度較好。

蜂蜜中抗生素殘留的濃度通常處于微量水平，其對(duì)于檢測(cè)技術(shù)的要求也較高。目前，HPLCMS/MS 大多采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)抗生素，因?yàn)槠鋬H采集特定的子離子質(zhì)譜信號(hào)，基質(zhì)干擾被大幅度降低，在對(duì)蜂蜜中抗生素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，相比于高效液相色譜法，其檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度也較高，但質(zhì)譜儀器價(jià)格昂貴，對(duì)于流動(dòng)相要求嚴(yán)格，因此在廣泛應(yīng)用方面還存在一定阻礙。

2.2 傳感器法

2.2.1 納米材料電化學(xué)傳感器 納米材料因具備許多的物理化學(xué)特性且擁有巨大的發(fā)展?jié)摿徒?jīng)濟(jì)影響，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。金屬基無機(jī)納米材料包括納米金屬元素和納米金屬氧化物等，由于其具有優(yōu)良的電子傳輸能力，因此經(jīng)常被用于食品檢測(cè)、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域中。碳基納米材料由于其化學(xué)穩(wěn)定性較好、機(jī)械強(qiáng)度高等特點(diǎn)也得到了廣泛應(yīng)用。

金屬納米粒子導(dǎo)電性強(qiáng)，但通常需要用特定的載體材料進(jìn)行固定來提高自身的穩(wěn)定性，而碳基納米材料導(dǎo)電性能較弱但穩(wěn)定性優(yōu)異，是構(gòu)建納米復(fù)合材料的理想載體，目前，對(duì)于金屬與碳基納米材料進(jìn)行復(fù)合應(yīng)用的研究越來越多。Mani 等利用二硫化鉬納米片（MoS）及多壁碳納米管（f-MWCNTs），通過水熱合成法制備了MoS/f-MWCNTs 納米復(fù)合材料，再將其滴涂在玻碳電極表面，利用構(gòu)建的電化學(xué)傳感器檢測(cè)氯霉素。結(jié)果顯示，納米復(fù)合膜修飾電極在0.08～1392 μmol/L 濃度范圍內(nèi)與氯霉素呈線性響應(yīng)，檢測(cè)限為0.015 μmol/L。將其應(yīng)用于蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)，將蜂蜜溶于磷酸緩沖液后分別加入適量5 及10 μmol/L 的CAP 標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)旋渦、離心、過濾后進(jìn)行檢測(cè)，其回收率可達(dá)96.2%～97.0%。該方法選用的MoS/fMWCNTs 納米復(fù)合材料具有良好的電化學(xué)性能，經(jīng)過復(fù)合材料修飾后的電極對(duì)氯霉素能夠起到優(yōu)良的電催化效應(yīng)，并且具備應(yīng)用于蜂蜜中抗生素檢測(cè)的可行性。Yi 等將鈀納米顆粒（Pd NPs）與氧化石墨烯（RGO）進(jìn)行復(fù)合（如圖1），利用RGO/Pd NPs 納米復(fù)合材料修飾玻碳電極（GCE）檢測(cè)氯霉素并將其應(yīng)用于蜂蜜樣品的檢測(cè)。研究結(jié)果表明其檢測(cè)限為0.05 μmol/L，檢測(cè)靈敏度高。并且實(shí)驗(yàn)在同一電極連續(xù)測(cè)量10 次CAP 的過程中峰值電流變化較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，證明RGO/Pd NPs/GCE 具有較好的重復(fù)性。在對(duì)蜂蜜樣品的檢測(cè)中，利用磷酸緩沖溶液適當(dāng)稀釋蜂蜜樣品，再分別加入0.2、0.5、0.8 μmol/L 的CAP 進(jìn)行檢測(cè)，其回收率為87.0%～97.0%，RSD＜4.1%。該研究的材料制備過程簡(jiǎn)單快速，構(gòu)建的電化學(xué)傳感器具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，金屬材料與碳基納米材料的結(jié)合使用提高了該傳感器的導(dǎo)電性能及催化性能。

圖1 RGO/Pd NPs 納米復(fù)合材料的合成過程示意圖[50]Fig.1 Schematic diagram of synthetic procedures of RGO/PdNPs nanocomposite[50]

將金屬與碳基納米材料進(jìn)行復(fù)合構(gòu)建電化學(xué)傳感器是一種改善電導(dǎo)率和電化學(xué)穩(wěn)定性的高效途徑。大多數(shù)蜂蜜中抗生素的殘留量較小，對(duì)于傳感器的檢測(cè)限要求較高，通過制備不同類型的納米復(fù)合材料，構(gòu)建出操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏的電化學(xué)傳感器應(yīng)用于蜂蜜中抗生素的檢測(cè)是未來的研究重點(diǎn)之一，并且納米材料之間會(huì)產(chǎn)生某種協(xié)同作用，對(duì)于其相互作用的過程目前并沒有完全深入研究，因此在納米材料電化學(xué)傳感器方面的研究還需進(jìn)一步加深。

2.2.2 分子印跡聚合物電化學(xué)傳感器 分子印跡聚合物（MIPs）是一種仿生合成的材料，能夠選擇性地附著到目標(biāo)分子上，將MIPs 組裝到電極表面制備而得的傳感器即為分子印跡聚合物電化學(xué)傳感器。MIPs 不僅制備過程簡(jiǎn)單、價(jià)格相對(duì)較低，并且對(duì)于其目標(biāo)分子具有高度選擇性，在檢測(cè)、定量等方面具有突出的特性。分子印跡聚合物電化學(xué)傳感器響應(yīng)速度快且檢測(cè)靈敏度高，因此可以應(yīng)用于蜂蜜中抗生素殘留的檢測(cè)。

MIPs 大多不具備導(dǎo)電性，將MIPs 和量子點(diǎn)結(jié)合應(yīng)用到傳感器的制備可實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。Chullasat 等將分子印跡聚合物包覆在量子點(diǎn)（MIP-QDs）上，采用MIP-QDs 作為探針測(cè)定阿莫西林的含量并應(yīng)用于蜂蜜樣品的測(cè)定。結(jié)果顯示隨著阿莫西林濃度的增加，其發(fā)光強(qiáng)度降低，其檢測(cè)限和定量限分別為0.14 和0.46 μg/L。并且采用MIP-QDs 和HPLC 法對(duì)提取的樣品溶液進(jìn)行分析對(duì)比，實(shí)驗(yàn)表明其建立的方法與高效液相色譜法一致，可用于食品中微量阿莫西林的測(cè)定。將本研究建立的方法用于檢測(cè)蜂蜜樣品，在蜂蜜中添加1.0、10、20、50 μg/L 4 種不同濃度的阿莫西林，其回收率為86%～98.5%，RSD＜4.8%。張慧潔等以CAP為模板分子，以沉淀法制備CAP 分子印跡聚合物（CAP-MIPs），將摻雜氮硫的碳量子點(diǎn)與MIPs 相結(jié)合，采用熒光分析法考察0.001～60 μmol/L 濃度的CAP 對(duì)分子印跡聚合物的熒光猝滅作用，隨著 CAP濃度遞增，其熒光強(qiáng)度逐漸降低，結(jié)果顯示其方法檢出限為6×10μmol/L。在對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在蜂蜜中加入甲醇，經(jīng)渦旋、超聲、離心后取上清液加入磷酸緩沖溶液，分別加入1.0、3.0、5.0 μg/g的CAP 進(jìn)行熒光光譜分析，結(jié)果表明其加標(biāo)回收率為90.0%～98.2%，RSD＜5.1%。二者的研究表明將MIPs 與量子點(diǎn)相結(jié)合作為一種光致發(fā)光探針用于熒光光譜法分析，其操作簡(jiǎn)單、設(shè)備成本低，將其結(jié)合使用制備得到的傳感器可用于選擇性測(cè)定蜂蜜中的抗生素含量。Bougrini 等以四環(huán)素（TC）為模板分子，利用修飾 p-氨基巰基酚的金納米顆粒作為載體，電聚合制備了一種用于檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素的分子印跡傳感器（如圖2）。實(shí)驗(yàn)以鐵氰酸鹽為氧化還原探針，用線性掃描伏安法對(duì)電化學(xué)傳感器進(jìn)行了表征，研究表明該傳感器的線性范圍為2.24×10～22.4 nmol/L，檢出限為2.2×10nmol/L。利用該方法測(cè)定蜂蜜樣品中四環(huán)素的含量，分別添加8.65、11.65 mol/L 的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其加標(biāo)回收率為101.8%～106.0%，RSD＜8.3%。該研究將納米顆粒與MIPs 進(jìn)行結(jié)合，通過改進(jìn)MIPs 的制備提高了傳感器的導(dǎo)電性及催化活性，對(duì)蜂蜜樣品中四環(huán)素進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其檢測(cè)靈敏度也有所提高。

圖2 基于金納米粒子的四環(huán)素分子印跡傳感器示意圖[62]Fig.2 Schematic diagram of tetracycline molecularly imprinted sensor based on AuNPs[62]

分子印跡聚合物因其高效、準(zhǔn)確、能有效分離復(fù)雜樣品組分和成本低的特點(diǎn)在食品檢測(cè)分析領(lǐng)域不斷擴(kuò)展應(yīng)用。未來還需不斷改進(jìn)制備MIPs 的技術(shù)手段，完善MIPs 的選擇性識(shí)別理論體系，使其在蜂蜜中抗生素殘留檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用。

2.2.3 核酸適配體傳感器 核酸適配體（aptamer，Apt）是由單鏈DNA、寡核苷酸RNA 或短肽組成的配體，其穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)，它們?cè)诟街绞缴项愃朴诓煌愋偷目贵w，核酸適配體傳感器是將二者的識(shí)別和結(jié)合作用轉(zhuǎn)化為光學(xué)、電化學(xué)等檢測(cè)信號(hào)，利用其可以直接識(shí)別和捕獲目標(biāo)，從而建立靈敏、快捷的檢測(cè)方法，適用于蜂蜜樣品快速、小型的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

核酸適配體和納米材料的復(fù)合應(yīng)用因能放大響應(yīng)信號(hào)、顯著提高檢測(cè)精準(zhǔn)度而受到越來越多的關(guān)注。唐亞利通過構(gòu)建出基于氧化石墨烯-核酸適配體傳感器用于檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素的殘留。將一定量的核酸適配體溶液與氧化石墨烯混合，通過加入不同濃度的四環(huán)素進(jìn)行孵育、離心，取上清液測(cè)定其吸光度值。結(jié)果顯示，該傳感器的四環(huán)素檢測(cè)限為1.0×10ng/mL，線性范圍為0.002～20 ng/mL。在對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在蜂蜜中分別加入0.001、0.01、0.1 mg/kg 3 個(gè)水平的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，再通過添加Mcllvaine 緩沖溶液、三氯乙酸去除樣品中的金屬離子，經(jīng)渦旋、離心、稀釋后測(cè)定其樣品回收率達(dá)82.5%～117%。Liu 等制備了基于石墨烯-三維結(jié)構(gòu)納米金復(fù)合材料（GR-3D Au）和核酸適配體-Au NPs-辣根過氧化物酶納米探針構(gòu)建了一種用于檢測(cè)土霉素（OTC）的電化學(xué)核酸適配體傳感器（如圖3），并利用該傳感器對(duì)蜂蜜中的OTC 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該傳感器的檢測(cè)限可達(dá)4.98×10g/L。二者的研究表明，在蜂蜜樣品的檢測(cè)中，所構(gòu)建的核酸適配體傳感器通過傳遞出可定量處理的光、電信號(hào)使其能夠?qū)Ψ涿壑锌股貧埩暨M(jìn)行快速分析檢測(cè)，并且檢測(cè)的成本較低、靈敏度較高。

圖3 用于土霉素檢測(cè)的核酸適配體傳感器示意圖[69]Fig.3 Schematic of the aptasensor for the detection of OTC[69]

核酸適配體與抗體相比具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、易于合成、價(jià)格便宜且標(biāo)記相對(duì)容易等優(yōu)點(diǎn)。核酸適配體可以被應(yīng)用于蜂蜜樣品中抗生素的檢測(cè)，但是核酸適配體傳感器易受到蜂蜜中其他基質(zhì)的干擾，對(duì)于如何避免物質(zhì)所帶來的干擾和保持傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度等問題還需要進(jìn)一步研究。

2.2.4 免疫傳感器 免疫傳感器是一種基于抗原分子識(shí)別的傳感器。由于抗體和特定物質(zhì)或相應(yīng)抗原的特異性結(jié)合使免疫傳感器具備了獨(dú)特的選擇性和較高的靈敏度。隨著傳感器技術(shù)的快速發(fā)展，為了改善免疫傳感器的檢測(cè)性能，提高其傳感效率，有研究將納米材料與免疫傳感器相結(jié)合使用，使其在食品檢測(cè)領(lǐng)域逐漸得到了更多研究者的認(rèn)可。

Cervera 等開發(fā)了一種基于高頻石英晶體微天平（HFF-QCMD）技術(shù)的壓電免疫傳感器，實(shí)驗(yàn)使用100 MHz 石英作為傳感器，利用特異性單克隆抗體作為生物識(shí)別元件檢測(cè)蜂蜜中磺胺噻唑的殘留。通過Strata-X SPE 聚合物固相萃取柱對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理，再利用構(gòu)建的免疫傳感器進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，該傳感器的檢測(cè)限為0.10 μg/kg，定量限為2 μg/kg。在蜂蜜中加入10、50、100 μg/kg 3 個(gè)水平的磺胺噻唑樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其樣品回收率可達(dá)100%～113%，該方法的檢測(cè)限比其他報(bào)道的蜂蜜磺胺噻唑檢測(cè)方法低40～50 倍，蜂蜜預(yù)處理高效、快速、簡(jiǎn)單。Nadia 等研發(fā)了一種基于金微電極修飾的生物微電子機(jī)械系統(tǒng)（Bio-MEMS）的免疫傳感器檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素，由于利用納米粒子的表面修飾使其靈敏度得到了提高，且在樣品預(yù)處理時(shí)不需要任何復(fù)雜的步驟。結(jié)果顯示其檢測(cè)限為1.2 pg/mL。根據(jù)以上研究表明，免疫傳感器是一種新穎、小型化且成本較低的檢測(cè)設(shè)備，其能夠檢測(cè)到蜂蜜中低水平的抗生素殘留，并且對(duì)于蜂蜜樣品的前處理沒有過多復(fù)雜的要求，非常有利于大量蜂蜜樣品的快速、便捷檢測(cè)。

對(duì)比常規(guī)檢測(cè)手段，免疫傳感器具備簡(jiǎn)便、快速高效、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但目前免疫傳感器還沒有成為食品檢測(cè)的主要應(yīng)用技術(shù)，未來提高傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性是一個(gè)重要的研究方向。

2.3 免疫分析法

免疫分析法是利用放射性同位素、酶、熒光或其它物質(zhì)作為標(biāo)記劑，基于特異性抗原與抗體相互作用催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)的分析方法。常用于檢測(cè)蜂蜜中抗生素殘留的方法為酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和側(cè)流免疫層析法（lateral flow immunoassay，LFIA）。

ELISA 是選擇用酶對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)顯色程度來定量檢測(cè)抗生素，其可在復(fù)雜的樣品基質(zhì)中選擇性檢測(cè)微量物質(zhì)。Kumar 等采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)蜂蜜樣品中的CAP 殘留，將蜂蜜樣品溶于NaEDTA-MclIvaine 緩沖液，利用HLB 固相萃取小柱提取抗生素。使用微孔板分光光度計(jì)在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量其吸光度，結(jié)果顯示該方法檢測(cè)限為0.05 ng/g，分別添加1、2、4 ng/g 3 個(gè)水平的CAP標(biāo)準(zhǔn)品，其加標(biāo)回收率為77.3%～83.1%，RSD＜1.3%。Wu 等通過制備CAP 特異性抗體建立了靈敏的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（dcELISA）和金納米顆粒免疫層析條（immunostrip）兩種方法檢測(cè)蜂蜜中的CAP。將不同濃度的CAP 溶液添加到蜂蜜樣品中，加入磷酸緩沖溶液后離心、提取上清液，再用含有吐溫-20 和牛血清白蛋白的磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋，用于后續(xù)蜂蜜樣品的檢測(cè)。在dcELISA 中，其對(duì)CAP 的檢出限為0.15 ng/mL，在蜂蜜樣品中添加0.25～100 ng/g的CAP 樣品，其回收率為71.9%～94.7%。免疫條檢測(cè)CAP 的機(jī)理如圖4 所示，將免疫條插入樣品孔中，當(dāng)CAP 含量超過0.5 ng/mL 時(shí)，免疫條上會(huì)消失一條紅色檢測(cè)線，即定義為免疫條的視覺檢測(cè)限為0.5 ng/mL。研究結(jié)果表明，ELISA 法和免疫層析條檢測(cè)方法均可以應(yīng)用到蜂蜜中CAP 的檢測(cè)。但免疫層析條方法主要依靠于檢測(cè)限的顯色且采用人眼觀察判定，但人眼視覺判別具有一定的誤差性，該方法更適用于蜂蜜的定性檢測(cè)。ELISA 法較依賴于溫度控制裝置且只能提供定量檢測(cè)，為了避免此種方法的使用弊端，有研究對(duì)LFIA 進(jìn)行了應(yīng)用分析。LFIA 利用磁性納米顆粒、發(fā)光納米顆粒等標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)檢測(cè)限區(qū)域的信號(hào)顏色變化及信號(hào)強(qiáng)度查看檢測(cè)結(jié)果。Li 等通過簡(jiǎn)單的樣品制備策略、基于LFIA 條帶和手持傳感器讀取器建立了一種蜂蜜抗生素殘留檢測(cè)系統(tǒng)。利用與抗生素單克隆抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)微球探針，LFIA 條帶可同時(shí)檢測(cè)磺胺類藥物和四環(huán)素類藥物，手持式傳感器讀取器可以自動(dòng)進(jìn)行圖像記錄、熒光信號(hào)提取和抗生素定量，該方法的檢出限為0.4 μg/kg，其靈敏度高，且特異性較好。

圖4 用于氯霉素檢測(cè)的免疫層析條示意圖[80]Fig.4 Schematic diagram of immunochromatographic strip for chloramphenicol detection[80]

免疫分析法具備檢測(cè)成本低、效率高、靈敏度好且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但由于其基于一類化合物的共同基團(tuán)發(fā)生免疫反應(yīng)的原理，使得此方法不能對(duì)每種化合物分別檢測(cè)并定量，并且若蜂蜜中的抗生素沒有相對(duì)應(yīng)的抗原，則不能進(jìn)行檢測(cè)，其應(yīng)用具有一定的局限性。

3 結(jié)論與展望

本文對(duì)蜂蜜中抗生素的殘留現(xiàn)狀及檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，就檢測(cè)方法而言，色譜法目前應(yīng)用較為廣泛，并且有許多研究者通過對(duì)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的檢測(cè)條件進(jìn)行改善，使其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜中多種類抗生素的同時(shí)檢測(cè)，但該方法設(shè)備昂貴，目前無法實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜檢測(cè)的普遍應(yīng)用。免疫分析法成本較低且操作簡(jiǎn)便，但該方法依賴于特定的抗原，若沒有對(duì)應(yīng)抗原則無法進(jìn)行檢測(cè)，因此在一定程度上限制了其使用。傳感器法檢測(cè)的靈敏度高、檢測(cè)成本較低，并且其設(shè)備型號(hào)小，增加了使用的便攜性，可用于實(shí)現(xiàn)蜂蜜的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。傳感器法是目前檢測(cè)和定量蜂蜜中抗生素殘留的有前途的方法之一，其中電化學(xué)傳感器可以達(dá)到快速響應(yīng)和高靈敏度的檢測(cè)效果，具有良好的發(fā)展前景。因此，在保持其檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)上，開發(fā)電導(dǎo)率和催化活性更好的電極材料、優(yōu)化樣品的前處理方法、提高檢測(cè)效率是今后的研究重點(diǎn)之一。未來還要通過不斷改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)、開發(fā)新型檢測(cè)方法來提高蜂蜜中抗生素殘留的定性定量分析水平，建立更加完善、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法。