• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于分子對接技術研究魚源抗凍多肽與魚肌球蛋白的相互作用

    2022-10-11 07:25:54江文婷蔡茜茜楊傅佳黃建聯(lián)汪少蕓
    食品工業(yè)科技 2022年20期
    關鍵詞:重鏈肌球蛋白冰晶

    江文婷,陳 旭,蔡茜茜,楊傅佳,黃 丹,黃建聯(lián), ,汪少蕓,

    (1.福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108;2.福建省冷凍調理水產品加工重點實驗室,福建廈門 361022;3.福建安井食品集團股份有限公司,福建廈門 361022)

    我國水域遼闊,生物資源豐富,是世界上漁業(yè)資源最豐富的國家。海鱸魚營養(yǎng)豐富,養(yǎng)殖產量高,常用于加工生產魚糜制品,深受消費者的喜愛,產量和市場需求逐年增加。魚糜及魚糜制品在加工、儲存、運輸等過程中產生的冰晶生長和重結晶問題會導致魚糜蛋白質的冷凍變性,使其分子內部原有的高度規(guī)律性的空間結構發(fā)生變化,導致蛋白質的理化性質和生物學性質都有所改變,是影響凍藏品質的關鍵。其中,魚糜蛋白中的肌球蛋白是凝膠形成最主要的功能成分,影響著肉制品的品質。肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain,MHC)具有與完整肌球蛋白形成凝膠的相同能力。而肌球蛋白輕鏈不能單獨形成凝膠,只在肌球蛋白重鏈堿基凝膠形成中起輔助作用。因此,肌球蛋白重鏈在肌球蛋白形成凝膠三維網狀結構的過程中起著非常重要的作用。

    抗凍多肽是一類小分子蛋白或蛋白質水解物,它是抗凍蛋白中局部具有抗凍活性的特異多肽鏈結構域??箖龆嚯脑诮Y冰或亞結冰狀態(tài)下能保護生物體免受傷害,它能非依數性降低溶液冰點、有效降低冰晶生長率、抑制冰晶重結晶的發(fā)生,抑制凍結所造成的低溫損傷。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽,在低溫凍融循環(huán)中對魚糜表現(xiàn)出保護作用。為研究魚源膠原蛋白抗凍多肽對魚糜的保護機制,本文使用不同蛋白酶酶解魚源膠原蛋白,以嗜熱鏈球菌的低溫保護活性為指標篩選出能酶解產生高活性抗凍多肽的蛋白酶。為簡化分離純化及質譜等繁鎖步驟,通過計算機模擬酶解魚源膠原蛋白并預測活性肽性質,得到能與肌球蛋白直接作用的抗凍多肽序列,利用同源建模構建海鱸魚肌球蛋白重鏈的空間結構。通過分子模擬技術探究抗凍多肽與海鱸魚肌球蛋白的相互作用,以期為今后冷凍魚糜產品開發(fā)應用提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    魚鱗膠原蛋白() 安井食品集團股份有限公司;嗜熱鏈球菌() 上海交通大學農業(yè)與生物學院;風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純;海鱸魚肌球蛋白重鏈(GenBank Accession No:AGT60847.1) 美國國立生物技術信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/);魚源膠原蛋白O93484 蛋白質數據庫UniProt(https://www.uniprot.org/)。

    SW-CJ-1F 超凈工作臺 上海博迅公司;Genesys 10S 紫外可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific 公司;214 差示掃描量熱儀 德國Netzsch 公司;SMZ-745T 體視顯微鏡、D-7500CCD 高清相機日本Nikon 公司;RT4加熱制冷循環(huán)器 德國VIVO 公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 魚源膠原蛋白的酶解 犁齒鯛魚鱗清洗、烘干后粉碎成絮狀。底物濃度3%(w/v),超聲90 min(50 ℃,200 W),高溫處理1 h(121 ℃,0.1 MPa),冷卻后調節(jié)至酶最佳pH,分別加入5%(w/w)酶底比的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶,在酶最適溫度下酶解6 h,沸水浴滅酶后離心取上清液凍干。

    1.2.2 抗凍多肽的低溫保護活性測定 取50 μL 二次活化的嗜熱鏈球菌接種到4 mL M17 液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)4 h(37 ℃,180 r/min),5000 r/min 離心10 min,收集菌泥,用等體積的無菌水洗滌兩次后重懸于兩倍的無菌水中,獲得嗜熱鏈球菌菌液。分別從不同酶解液中取540 μL 加60 μL 菌液混勻,540 μL 生理鹽水加60 μL 菌液做空白組。吸取50 μL 到4 mL M17培養(yǎng)液中,培養(yǎng)7 h,檢測600 nm 處的吸光值A,剩余的菌液于-20 ℃冷凍24 h 且在起始時間內間隔2 h 進行兩次凍融循環(huán)。之后將菌液37 ℃水浴解凍10 min,再次取50 μL 接種培養(yǎng)7 h 后測吸光值A。根據公式(1)計算存活率。

    式中:A表示冷凍前菌液OD;A表示冷凍后菌液OD。

    1.2.3 熱滯活性測定 熱滯活性測定參照Wu 等方法稍作變化。取5 μL 15 mg/mL 樣品或牛血清蛋白到鋁樣品盤,參比組為空白鋁樣品盤,將二者同時置入差示掃描量熱儀中,以-2 ℃/min 速率降溫至-30 ℃,平衡5 min,再以2 ℃/min 速率升溫至保留溫度(-0.5、-0.3、0 ℃),使樣品處于部分熔融狀態(tài),平衡5 min。根據DSC 熱流曲線分析樣品的抗凍活性。冰晶含量(Φ )和THA 分別按照公式(2)和(3)計算。

    式中:Φ 為樣品中的冰晶含量(%);△H為保留溫度停留后繼續(xù)降溫過程中體系的放熱焓(J/g);△H為樣品結晶的總放熱焓(J/g);T為保留溫度(℃),即樣品熔融峰所涵蓋溫度區(qū)間的某一溫度;T體系融化部分再次凍結時的起始溫度(℃)。

    1.2.4 重結晶抑制活性測定 取3 μL AFPs(1.0 mg/mL,20%蔗糖溶液配制)于載玻片上,蓋上蓋玻片,置于冷臺上。以-20 ℃/min 速率快速冷卻至-20 ℃并維持5 min,使其完全凍結;再以5C/min 速率逐漸升溫至-6 ℃,保持1 min;再以1 ℃/min 讓樣品在-8~-6 ℃之間循環(huán),模擬溫度波動環(huán)境下的重結晶情況。并在-6 ℃分別保持0、10、30 min,通過CCD 相機采集循環(huán)前后冰晶形態(tài)圖像,通過OPLENIC軟件分析冰晶尺寸變化。20%蔗糖溶液做空白組,BSA(1.0 mg/L,20%蔗糖溶液配制)做對照組。

    1.2.5 計算機模擬酶解 在UniProt 數據庫中搜索魚源膠原蛋白,選取O93484 膠原蛋白序列,通過酶切工具Peptide Cutter(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)選擇胰蛋白酶進行模擬酶解。

    1.2.6 活性肽的性質預測 使用活性預測工具Peptide Ranker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)對酶解獲得的多肽片段活性進行預測,篩選高活性(>0.5)的肽片段。使用毒性預測工具ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php)篩選無毒的活性肽。使用抗凍蛋白/抗凍多肽數據庫CryoProtect(http://codes.bio/cryoprotect/)篩選屬于抗凍多肽的肽序列。

    1.2.7 海鱸魚肌球蛋白重鏈的同源建模 分別使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)、ITASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)對肌球蛋白重鏈進行同源建模,選擇準確度高的建模結果。

    1.2.8 分子對接 使用Discovery studio 2019 軟件進行分子對接。進行''Prepare Protein''的前處理操作去除肌球蛋白重鏈晶體的水分子和配體并定義為受體。配體活性肽通過''Prepare Ligands''前處理并通過''Full Minimization''進行CHARMm 力場最小化優(yōu)化結構。處理后的肌球蛋白重鏈晶體以及抗凍多肽分別進行Dock Ligands(CDOCKER)分子對接。篩選結果中對接成功的化合物,并選取分值最高的對接結果。

    1.2.9 分子動力學模擬 分子動力學模擬使用Discovery studio 2019 軟件進行。將分子對接的蛋白-多肽復合物導入,進行''Prepare Protein''前處理,添加力場charmm36,進行Solvation 流程溶劑化復合物。打開動力學流程Standard Dynamics Cascade,設置Simulation Time(ps)為20、Simulation Time(ps)為200、Number of Processors 為8,其它參數保持默認。

    2 結果與分析

    2.1 不同酶解產物的抗凍活性

    選用五種蛋白酶分別測定不同酶解物的抗凍活性,以嗜熱鏈球菌的低溫保護活性為檢測指標,結果如圖1。由圖可知,經過胰蛋白酶的水解后,魚鱗酶解物對嗜熱鏈球菌存活率顯著提高(<0.05),達到80.35%±4.39%。后續(xù)對其抗凍活性進行表征,并命名為AFPs。

    圖1 不同蛋白酶對嗜熱鏈球菌存活率的影響Fig.1 Effect of different proteases on the viability of S.thermophiles

    2.2 熱滯活性

    在不同保留溫度下測定了BSA 和AFPs 的部分融化過程DSC 曲線,二者相應的DSC 熱流曲線結果如表1 所示。隨著保留溫度T的上升,BSA 組的冰核百分含量(Φ)從91.8%下降到38.2%,而AFPs組的冰核百分含量(Φ)從44.7%下降到5.3%。在相同保留溫度時,AFPs 的冰核含量明顯低于BSA,而熱滯活性高于BSA。說明當T越接近樣品融點時,Φ 含量越低,THA 越高,THA 與冰核百分含量(Φ)存在一定的負相關關系。

    表1 BSA 和AFPs 的凍結起始溫度、保留溫度、冰晶含量和熱滯活性Table 1 Freezing initiation temperature,retention temperature,ice crystal content and thermal hysteresis activity of BSA and AFPs

    2.3 重結晶抑制活性

    大冰晶的表面能小于小冰晶的表面能,凍融過程中小冰晶不斷聚合形成大冰晶,產生冰重結晶現(xiàn)象。而抗凍多肽可以使冷凍溶液中冰晶保持小尺寸狀態(tài),抑制冰晶的重結晶。如圖2 所示,在含有AFPs 的溶液中,冰晶尺寸小于同濃度的BSA 溶液和空白組。

    圖2 水分子重結晶顯微成像Fig.2 Photomicroscope images showing inhibition of ice recrystallization

    2.4 計算機輔助挖掘魚源抗凍多肽

    選擇PeptideCutter 中的胰蛋白酶對魚源膠原蛋白進行酶解切割,通過模擬酶解方法,省去分離純化及質譜等步驟。經模擬酶解后1356 個氨基酸的魚源膠原蛋白序列被酶解為115 條肽段,具體結果如表2 所示。

    表2 模擬酶解肽段序列及切割位點Table 2 Mimic enzymatic hydrolysis peptide sequence and cleavage site

    2.5 魚源抗凍多肽的篩選

    將所有肽段進行Peptide Ranker 活性預測,選擇預測活性分數大于0.5 的共47 條肽段序列,并對其進行ToxinPred 毒性預測,結果表明除GATGPGGIR序列外其余序列皆無毒,使用抗凍蛋白/抗凍多肽數據庫CryoProtect 篩選,結果表明除R 序列外其余序列皆屬于潛在的抗凍多肽。具體結果如表3。

    表3 肽段序列活性、毒性分析及抗凍活性預測Table 3 Peptide sequence activity,toxicity analysis and antifreeze activity prediction

    2.6 魚肌球蛋白的同源建模

    對海鱸魚肌球蛋白重鏈進行同源建模,采用SWISS-MODEL 構建的三維結構模型見圖3a,ITASSER 構建的三維結構模型見圖3b。為進一步說明同源建模結果的合理性,通過SAVESv6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)對建模結果進行評估。拉式構像圖(Ramachandran plot)是描述蛋白質結構中氨基酸殘基二面角ψ 和φ 是否在合理區(qū)域的一種可視化方法,也可以反映出該蛋白質的構象是否合理。由圖4a、圖4c 可知,SWISS-MODEL 構建的三維結構模型有氨基酸88.9%落在完全允許區(qū),9.2%落在允許區(qū),0.9%落在最大允許區(qū),0.9%落在不允許區(qū),99.1%落在合理的區(qū)域。I-TASSER 構建的三維結構模型有氨基酸81.6%落在完全允許區(qū),16.1%落在允許區(qū),2.3%落在最大允許區(qū),沒有落在不允許區(qū)氨基酸,100%落在合理的區(qū)域。

    圖3 海鱸魚肌球蛋白重鏈同源建模的三維結構Fig.3 3D structure of sea bass myosin heavy chain homology modeling

    蛋白三維結構準確性隨著整體質量因素值的增加而增加。通常,高分辨率晶體結構的值可以達到95%,而分辨率較低的結構的值只能達到大約91%。由圖4b、圖4d 可知,SWISS-MODEL 構建的三維結構模型精確值為92.661%,I-TASSER 構建的三維結構模型精確值為96.154%。與高分辨率晶體結構更接近,表明I-TASSER 構建的三維結構模型的準確性相對較高。故I-TASSER構建的三維蛋白結構模型更可靠,用于后續(xù)的分子對接研究。

    圖4 建模結果評估Fig.4 Modeling result evaluation

    2.7 抗凍多肽與魚肌球蛋白重鏈的分子對接

    與肌球蛋白重鏈對接上的抗凍多肽序列共有GR、GMK、GAR、GPR、GPAGGK 五條。Graham等從雪蚤中純化的抗凍蛋白氨基酸序列為GAA GAGSSGP。Cao 等通過序列分析推導出AP-3 抗凍蛋白氨基酸組成為GLLGPLGPRGL。Wang 等純化的鯊魚皮膠原蛋白抗凍多肽氨基酸序列為GAIGPAGPLGP。Nikoo 等從黑龍江鱘魚皮明膠中提取的抗凍多肽是PAGT,并驗證出PAGT 在肉糜模型系統(tǒng)中具有抗氧化和冷凍保護作用。Damodara 等分離的魚明膠抗凍多肽氨基酸序列為KDGTPGQFGP(OH)PGAPGKGN(OH)H、NEGT PGTGPAGPP(OH)GFHTPK(OH)W,它們都含有GTPG-和GPP(OH)G-結構指紋。綜上,選擇更符合膠原蛋白抗凍多肽的序列GPR 與GPAGGK 進行進一步對接及動力學分析。

    選擇的對接結合空腔坐標為64.5359、85.5816、76.7437、半徑為8,GPR 和GPAGGK 與肌球蛋白重鏈的對接結果如圖5a、圖5b 所示,對接位點2D 示意圖如圖6 所示,模擬酶解肽段GPR 可以與MHC 中Ile34 氨基酸形成碳氫鍵,與Asp76 氨基酸形成靜電作用,與Ala75、Asp76、Ile77 氨基酸形成氫鍵,還能以范德華力與Ile9、Gln33、Asn38、Ala40、Ile62、Arg63、Ile64、Phe155 氨基酸結合。模擬酶解肽段GPAGGK 可以與MHC 中Ala75 氨基酸形成氫鍵,還能以范德華力與Gln33、Ala37、Leu41、Phe58、Gly59、Phe61、Ile62、Ser74、Asp76、Ile77、Glu78、Thr79、Tyr80、Leu153 氨基酸結合。

    圖5 抗凍多肽與肌球蛋白重鏈的分子對接Fig.5 Molecular docking of antifreeze peptides and myosin heavy chain

    圖6 對接2D 示意圖Fig.6 2D diagrams of docking

    在凍藏過程中,首先被凍結的為組織內的自由水。隨著凍結時間的延長,自由水完全轉化為冰后與蛋白質結合的結合水也開始發(fā)生凍結,脫離蛋白,從而導致疏水鍵及二硫鍵等化學鍵的形成并聚集,蛋白的各個側鏈相互聚集,發(fā)生不可逆的變性??箖龆嚯目梢酝ㄟ^氫鍵、疏水相互作用和范德華力等分子之間作用力,吸附在液體冰晶表面,阻礙了冰晶在固、液界面位移及與水分子的結合。通過抗凍多肽與肌球蛋白重鏈的分子對接發(fā)現(xiàn),抗凍多肽還可以通過氫鍵、范德華力等分子間作用力與肌球蛋白直接作用,結合在肌球蛋白的結構空腔上,影響疏水鍵及二硫鍵等化學鍵的形成,阻礙蛋白側鏈聚集與結構改變,對冰晶的位移也有一定影響作用。

    2.8 抗凍多肽與海鱸魚肌球蛋白重鏈的分子動力學模擬

    通過繪制蛋白質的RMSD 作為構象變化的函數,可以可視化整體蛋白質穩(wěn)定性。在分子動力學模擬中,RMSD 用于評估與初始蛋白質結構的結構偏差(即估計蛋白質完整性)。RMSD 連續(xù)增加至高值表明構象不穩(wěn)定。MHC、MHC-GPR 和MHCGPAGGK 計算出的RMSD 值如圖7a 所示。RMSD值隨著構象變化逐漸增加,MHC 的RMSD 值在構象60 時達到最大,波動約為0.8 ?;MHC-GPR 的RMSD 值在構象73 時達到最大,波動約為1.5 ?;MHC-GPAGGK 的RMSD 值相較其他較為穩(wěn)定,波動約為0.5 ?,這些波動可能是因為肌球蛋白三級和二級結構的變化。與單獨的MHC 相比MHC-GPR初始穩(wěn)定性會提高,但隨著溫度和時間變化,構象會變得更不穩(wěn)定,這可能是因為GPR 與MHC 的結合并不牢固。而MHC-GPAGGK 可以使蛋白在溫度和時間的變化中變得構象更加穩(wěn)定。

    圖7 分子動力學模擬結果Fig.7 Molecular dynamics simulation results

    為了進一步表征肌球蛋白重鏈的構象靈活性,繪制了RMSF 作為殘基數的函數。RMSF 值是殘留靈活性的標準。如圖7b 所示,殘基17~32,173~187和214~231 的RMSF 值顯著增加。這些具有較大RMSF 波動的位置是肌球蛋白重鏈柔性較大的區(qū)域,推測是肌球蛋白重鏈與抗凍多肽作用的位置。通過RMSD 與RMSF 的結果,可以發(fā)現(xiàn),抗凍多肽GPAGGK 與肌球蛋白結合可以在溫度變化的過程中,穩(wěn)定構象,延緩蛋白變性。

    3 結論

    本研究發(fā)現(xiàn)魚源膠原蛋白的胰蛋白酶酶解物具有較高的抗凍活性,使用胰蛋白酶模擬酶解魚源膠原蛋白,運用計算機篩選得到抗凍多肽,省去分離純化及質譜等步驟。并與同源建模后的海鱸魚肌球蛋白重鏈進行分子模擬,以研究魚源膠原蛋白抗凍多肽對肌球蛋白的保護機制。分子對接結果表明,肽段GPR 和GPAGGK 能夠通過碳氫鍵、氫鍵和范德華力等分子作用力對海鱸魚肌球蛋白的結構及聚集行為產生影響,阻礙蛋白側鏈聚集、結構改變和冰晶的位移等。分子動力學結果表明,肽段GPAGGK 比肽段GPR 結合的更穩(wěn)定,由此結果可預測肽段GPAGGK 對魚糜及魚糜制品在冷凍貯藏中的品質保持起到更明顯的作用,GPAGGK 可作為潛在的抗凍劑應用于后續(xù)抗凍魚糜產品的研發(fā)。

    猜你喜歡
    重鏈肌球蛋白冰晶
    冰晶世界,凝凍微觀的美麗
    雪為什么只在冬天下
    小泥人冰晶畫 蘊藏大商機
    中國比較醫(yī)學雜志(2018年6期)2018-06-26 07:27:22
    一種新型的利用DSS交聯(lián)劑避免重鏈輕鏈干擾的免疫沉淀技術
    科教導刊(2017年10期)2017-06-09 18:38:05
    心肌血管緊張素Ⅱ在運動和高血壓性心肌肥大時肌球蛋白重鏈變化中的作用探討
    冰晶奇域
    琴童(2016年5期)2016-05-14 15:43:58
    肌球蛋白磷酸化的研究進展
    高糖對體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞通透性及肌球蛋白輕鏈磷酸化的影響
    鐵蛋白重鏈亞基納米載藥系統(tǒng)的構建及其特性
    a级毛色黄片| 91狼人影院| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产三级中文精品| 久久久久久久久久黄片| 成人无遮挡网站| 色av中文字幕| 色5月婷婷丁香| 永久网站在线| 日本 av在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 最近手机中文字幕大全| av黄色大香蕉| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 免费看美女性在线毛片视频| 免费在线观看成人毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| h日本视频在线播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 深夜a级毛片| or卡值多少钱| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美最黄视频在线播放免费| 我的老师免费观看完整版| 美女黄网站色视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 高清毛片免费看| 日韩精品中文字幕看吧| av国产免费在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 成年免费大片在线观看| 欧美日本视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品人妻久久久久久| 国产高潮美女av| 亚洲18禁久久av| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美三级亚洲精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 97碰自拍视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产在视频线在精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 91久久精品电影网| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成人三级黄色视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 波多野结衣高清无吗| 久久人人精品亚洲av| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲熟妇熟女久久| 男女之事视频高清在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人特级av手机在线观看| 黄色视频,在线免费观看| videossex国产| 在线看三级毛片| 男女那种视频在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 中文亚洲av片在线观看爽| 99久久久亚洲精品蜜臀av| АⅤ资源中文在线天堂| 少妇人妻精品综合一区二区 | 精品日产1卡2卡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 观看免费一级毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 九色成人免费人妻av| 国产真实乱freesex| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| av在线天堂中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品久久久久久久久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av美国av| 国产成人aa在线观看| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品在线观看二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 晚上一个人看的免费电影| 色综合色国产| 99热只有精品国产| 久99久视频精品免费| 国产精品人妻久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 一个人免费在线观看电影| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品一及| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 欧美日本视频| 一a级毛片在线观看| 一区二区三区免费毛片| 国产精品电影一区二区三区| 色在线成人网| а√天堂www在线а√下载| 内地一区二区视频在线| 欧美区成人在线视频| 天堂动漫精品| 久久久久性生活片| 婷婷亚洲欧美| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久国内精品自在自线图片| 99精品在免费线老司机午夜| 美女大奶头视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| av黄色大香蕉| 欧美+亚洲+日韩+国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲图色成人| av在线蜜桃| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人二区视频| 一个人看视频在线观看www免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 好男人在线观看高清免费视频| 18+在线观看网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人影院久久av| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产 一区精品| 夜夜爽天天搞| 99精品在免费线老司机午夜| 国产三级在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| 精品久久久久久久久久免费视频| av天堂在线播放| 欧美激情在线99| 国产综合懂色| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 黄色视频,在线免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | av.在线天堂| 国产一区二区在线av高清观看| 女人被狂操c到高潮| 欧美最新免费一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品野战在线观看| 22中文网久久字幕| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品亚洲美女久久久| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久九九精品二区国产| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av熟女| 免费看日本二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 一本久久中文字幕| 亚洲图色成人| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 免费看av在线观看网站| 国产精品久久久久久久电影| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美zozozo另类| 精品久久久噜噜| 精品人妻视频免费看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 91在线观看av| 99热只有精品国产| 成年女人毛片免费观看观看9| 成年女人看的毛片在线观看| 免费大片18禁| 午夜久久久久精精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 天天躁日日操中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 可以在线观看毛片的网站| 91av网一区二区| 亚洲四区av| 亚洲,欧美,日韩| 深夜精品福利| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久九九精品二区国产| 丝袜美腿在线中文| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产视频内射| 精品不卡国产一区二区三区| 免费大片18禁| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美bdsm另类| 热99re8久久精品国产| 亚洲经典国产精华液单| 听说在线观看完整版免费高清| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久久色成人| 国产精品国产高清国产av| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲图色成人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 可以在线观看的亚洲视频| 看十八女毛片水多多多| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜久久久久精精品| 嫩草影视91久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 香蕉av资源在线| 欧美丝袜亚洲另类| 一级黄色大片毛片| 超碰av人人做人人爽久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 村上凉子中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产免费男女视频| 国国产精品蜜臀av免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲美女黄片视频| 成人av在线播放网站| 婷婷精品国产亚洲av| 91久久精品国产一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 久久精品人妻少妇| 一级毛片我不卡| 成人永久免费在线观看视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 成年av动漫网址| 22中文网久久字幕| 春色校园在线视频观看| 看十八女毛片水多多多| 日本免费a在线| av专区在线播放| 99热网站在线观看| 美女高潮的动态| 12—13女人毛片做爰片一| 日本爱情动作片www.在线观看 | 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲18禁久久av| 欧美高清性xxxxhd video| 此物有八面人人有两片| 国产片特级美女逼逼视频| 白带黄色成豆腐渣| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久中文| 黑人高潮一二区| 午夜精品国产一区二区电影 | 在线观看一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品久久久久久久末码| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产成人aa在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 色播亚洲综合网| 久久久久免费精品人妻一区二区| 色哟哟·www| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品福利在线免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品国产高清国产av| 综合色av麻豆| 成人欧美大片| 哪里可以看免费的av片| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品,欧美在线| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品日韩av片在线观看| 热99re8久久精品国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲最大成人中文| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产亚洲精品av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜久久久久精精品| 在线观看一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 内地一区二区视频在线| 深夜a级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品一区二区性色av| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲av不卡在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人av在线播放网站| 一个人看的www免费观看视频| 18禁在线播放成人免费| 国产91av在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 深夜精品福利| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久久久免费精品人妻一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 午夜免费激情av| 国产精品野战在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 俺也久久电影网| 午夜日韩欧美国产| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线观看午夜福利视频| 国产乱人偷精品视频| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 少妇的逼水好多| avwww免费| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲欧美日韩东京热| 99热网站在线观看| 韩国av在线不卡| 亚洲经典国产精华液单| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| av视频在线观看入口| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产高清三级在线| 婷婷色综合大香蕉| 一进一出抽搐动态| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av成人av| 高清毛片免费看| av天堂在线播放| 99久国产av精品国产电影| 日本熟妇午夜| 色综合站精品国产| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 精品免费久久久久久久清纯| 又爽又黄a免费视频| 午夜福利在线在线| 日韩欧美精品免费久久| 日韩欧美在线乱码| avwww免费| 三级毛片av免费| 白带黄色成豆腐渣| 丰满乱子伦码专区| 国产精品永久免费网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 看非洲黑人一级黄片| 久久九九热精品免费| 亚洲最大成人中文| 亚洲熟妇熟女久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美成人a在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品三级大全| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产亚洲欧美98| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品一二三区在线看| av天堂在线播放| 国产亚洲欧美98| 国产真实伦视频高清在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 午夜精品国产一区二区电影 | 99在线人妻在线中文字幕| 国产色婷婷99| 九九热线精品视视频播放| 人人妻人人看人人澡| 综合色av麻豆| 伊人久久精品亚洲午夜| 嫩草影院入口| 国产极品精品免费视频能看的| 给我免费播放毛片高清在线观看| 22中文网久久字幕| 国产亚洲欧美98| 一级a爱片免费观看的视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久久久久久久大av| 午夜久久久久精精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人特级av手机在线观看| 日韩成人伦理影院| 最近中文字幕高清免费大全6| 成年版毛片免费区| 国产成人影院久久av| 国产成人精品久久久久久| 午夜爱爱视频在线播放| 午夜福利18| 亚洲av不卡在线观看| 久久99热这里只有精品18| 国产综合懂色| 久久精品综合一区二区三区| 国产午夜精品论理片| 两个人视频免费观看高清| 网址你懂的国产日韩在线| 在线观看午夜福利视频| 国产高潮美女av| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 老司机午夜福利在线观看视频| avwww免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 天堂√8在线中文| 赤兔流量卡办理| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久久九九精品二区国产| 麻豆乱淫一区二区| avwww免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品久久国产蜜桃| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 在线播放国产精品三级| 国产亚洲91精品色在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美zozozo另类| 欧美区成人在线视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品久久久久久av不卡| 三级国产精品欧美在线观看| 国内精品宾馆在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 深夜a级毛片| 男人的好看免费观看在线视频| 极品教师在线视频| 午夜福利在线在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美又色又爽又黄视频| 免费观看的影片在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 丝袜美腿在线中文| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久精品大字幕| www.色视频.com| 五月玫瑰六月丁香| 日本黄色片子视频| 日韩人妻高清精品专区| 春色校园在线视频观看| 国产毛片a区久久久久| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩成人伦理影院| 淫秽高清视频在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 深夜精品福利| 丝袜喷水一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费黄网站久久成人精品| eeuss影院久久| 极品教师在线视频| 一级a爱片免费观看的视频| 女人被狂操c到高潮| 色在线成人网| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 麻豆av噜噜一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久人人爽人人片av| 久久久午夜欧美精品| 午夜激情欧美在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成人性生交大片免费视频hd| 身体一侧抽搐| av女优亚洲男人天堂| 国产高清视频在线播放一区| 老司机影院成人| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线免费十八禁| 亚洲成人久久性| 亚洲人与动物交配视频| 色av中文字幕| 在线播放无遮挡| 欧美日韩乱码在线| 看十八女毛片水多多多| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黄色日韩在线| 国产精品久久视频播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 好男人在线观看高清免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费看av在线观看网站| 美女大奶头视频| 免费看日本二区| 深夜a级毛片| 中出人妻视频一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 免费看日本二区| av国产免费在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 一区福利在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩制服骚丝袜av| 老女人水多毛片| 亚洲自偷自拍三级| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一级毛片电影观看 | 日本色播在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美bdsm另类| 色尼玛亚洲综合影院| www.色视频.com| 成人美女网站在线观看视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲最大成人av| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜精品在线福利| 97碰自拍视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 草草在线视频免费看| 国产av一区在线观看免费| 美女黄网站色视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产高清视频在线观看网站| 在线国产一区二区在线| 欧美性感艳星| 日韩在线高清观看一区二区三区| 舔av片在线| 国产伦在线观看视频一区| 我要搜黄色片| 成年版毛片免费区| 久久久久九九精品影院| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇熟女欧美另类| 精品人妻视频免费看| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲综合色惰| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av在线亚洲专区| 久久6这里有精品| 免费观看的影片在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 国产淫片久久久久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 免费看日本二区| 久久久久久伊人网av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 啦啦啦韩国在线观看视频| 色哟哟·www| 国产伦一二天堂av在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 插逼视频在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲va在线va天堂va国产| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久性生活片| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产 一区 欧美 日韩| 97在线视频观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 97热精品久久久久久| 91久久精品电影网| 欧美丝袜亚洲另类| 色噜噜av男人的天堂激情| 丝袜喷水一区| 综合色av麻豆| 白带黄色成豆腐渣| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 校园春色视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色配什么色好看| 成人午夜高清在线视频| 在线a可以看的网站| 国产成人影院久久av| 精品人妻偷拍中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 |