Klotho蛋白及血鈣與重度子癇前期的關(guān)系研究

劉夕瓏，盧丹，榮茜，邢悅，潘碧瓊

(揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225000)

子癇前期(PE) 是妊娠特有疾病，是一種病情可呈持續(xù)性發(fā)展的動態(tài)疾病，患者可出現(xiàn)血壓增高、蛋白尿、水腫、頭痛、視力模糊、上腹疼痛甚至抽搐、昏迷等癥狀。有文獻(xiàn)報道，子癇前期在孕婦中患病率約為5%，重度子癇前期(SPE) 及其并發(fā)癥，如胎兒生長受限、腦血管意外、肝腎功能衰竭、胎盤早剝、產(chǎn)后出血等，是圍產(chǎn)期母兒死亡的重要原因。重度子癇前期是妊娠期高血壓較嚴(yán)重的一種類型，其發(fā)病機(jī)制現(xiàn)尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期的發(fā)生與子宮螺旋動脈重鑄不足、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，氧化應(yīng)激、胎盤植入及免疫功能等密切相關(guān)。Klotho 蛋白是腎臟分泌的一種抗衰老蛋白，在胎盤合胞滋養(yǎng)細(xì)胞中也有少量分泌，研究發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白在調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抗氧化、抗凋亡以及對臟器的保護(hù)方面有廣闊的應(yīng)用前景，本實驗通過免疫組化法測定試驗組胎盤中Klotho 蛋白的表達(dá)，聯(lián)合孕婦血清Ca濃度，為重度子癇前期的早診斷、早治療提供新的處理依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象選取揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2020年8月至2021年3月產(chǎn)科住院的83 例終止妊娠產(chǎn)婦，其中重度子癇前期患者43 例作為試驗組，正常孕婦40 例作為對照組，分娩后收集胎盤及臍血標(biāo)本并進(jìn)行相關(guān)處理。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：SPE 診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)人衛(wèi)版第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》：在PE 的基礎(chǔ)上合并以下任何一種表現(xiàn)：(1)收縮壓≥160 mmHg，或舒張壓≥110 mmHg(臥床休息，兩次間隔至少4 h)；(2) 血小板減少(血小板＜100×10/L)；(3) 右上腹或上腹部疼痛；肝功能損害(血清轉(zhuǎn)氨酶水平為正常值2 倍以上)；(4) 腎功能損害(血肌酐升高大于97.2 μmol/L 或為正常值2 倍以上)；(5) 肺水腫；(6) 新發(fā)生的腦功能或視覺障礙如頭痛視力模糊盲點復(fù)視等；(7) 胎兒生長受限(FGR)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 所有研究對象均為單胎妊娠且胎兒發(fā)育無異常，(2) 既往均無糖尿病、心臟病及肝、腎疾病史，(3) 無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 非單胎妊娠如雙胎及以上；(2) 本次妊娠通過輔助生殖技術(shù)受孕，包括人工授精、體外受精—胚胎移植等；(3)既往有慢性高血壓、慢性腎炎、嚴(yán)重心、肝等臟器疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等相關(guān)病史；(4) 孕期感染急慢性炎癥；(5) 患者資料不全及拒絕者。

孕婦診斷為SPE 收住入院予以吸氧、解痙、降壓、鎮(zhèn)靜和促胎肺成熟等治療，密切監(jiān)測孕婦自覺癥狀、生命體征、血壓、尿蛋白、血小板、凝血功能、肝腎功能等變化及胎兒宮內(nèi)情況，根據(jù)病情變化適時終止妊娠。本研究通過本院倫理委員會審批，所有患者的數(shù)據(jù)資料及標(biāo)本的收集均獲得患者本人的知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 資料收集

收集兩組孕婦入院時到分娩后的一般情況，包括：年齡、BMI、分娩孕周、孕次及產(chǎn)次、血壓；收集兩組研究對象的血樣；分析比較兩組孕婦血清鈣離子濃度。分娩后至出院前比較兩組產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥，如子癇、腦血管意外、HELLP 綜合征、低白蛋白血癥、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)、肝功能異常、胎兒生長受限(FGR)、胎盤早剝、視網(wǎng)膜病變、胸腹水、肺動脈高壓、分娩情況、產(chǎn)后出血、產(chǎn)褥感染發(fā)生情況及新生兒情況。

1.3 試劑

兔抗人Klotho 多克隆抗體購自美國Abcam 公司，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、即用SABC 型免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒購自邁新生物技術(shù)公司，ELISA 試劑盒購自SAB 公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化法測定胎盤組織Klotho 蛋白的表達(dá)

所有胎盤標(biāo)本均于胎盤娩出后10 min 內(nèi)收集，選擇胎盤母體面的無鈣化區(qū)，肉眼檢查新鮮胎盤，并從胎盤中心區(qū)域獲得無壞死或炎癥跡象的胎盤部分，剪取全層胎盤組織，迅速用無菌生理鹽水清洗干凈血塊和血液，干紗布凈除水分，分割成大小約1 cm×1 cm×1 cm 的塊狀，放入凍存管，于-80℃冰箱保存。取用時常溫解凍，置于10% 中性多聚甲醛液中固定24～48 h，然后常規(guī)制作成石蠟塊，4℃保存待用。采用免疫組化SABC 法測定胎盤組織Klotho 蛋白的表達(dá)。

1.4.2 ELISA 法檢測母血及臍血中Klotho 蛋白含量

所有孕婦入院后均禁食10～12 h，次日清晨采集空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心5 min，取上清，-80℃凍存。新生兒斷臍后10 min 內(nèi)行臍血采集：選擇距離胎盤斷端約5～10 cm，碘伏消毒兩遍，5 mL 注射器針頭斜面朝下或側(cè)面小角度刺入，見血后沿血管壁順行1～2 cm，采集臍血2～5 mL，存于4 ℃冰箱，5 000 r/min 離心5 min，取上清，-80℃凍存。所有標(biāo)本收齊后嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟，ELISA 法檢測母血及臍血中Klotho 蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕產(chǎn)婦一般情況比較

兩組研究對象的孕次、產(chǎn)次、身高、孕期體重增長情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組與對照組年齡、分娩孕周、收縮壓及舒張壓間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。見表1。

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般情況比較[(±s )/M(P 25，P 75)]

2.2 兩組孕婦母血鈣比較

試驗組血Ca(2.10±0.35)mmol/L 低于對照組(2.20±0.31)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。見表2。

表2 兩組孕婦母血鈣比較(±s)

2.3 胎盤組織的HE 染色

胎盤組織中可見成熟中間型絨毛，含毛細(xì)血管和細(xì)小動靜脈，間質(zhì)疏松，占絨毛體積的一半以上，血管腔占絨毛體積的一半以下，合體滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)一致。見圖1、圖2。

圖1 重度子癇前期胎盤組織HE 染色

圖2 重度子癇前期胎盤組織HE 染色

2.4 Klotho 蛋白在胎盤組織的定位表達(dá)

在對照組中，Klotho 蛋白主要表達(dá)于胎盤絨毛小葉的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛結(jié)締組織間隙。見圖3、圖4。試驗組Klotho 蛋白表達(dá)定位與對照組基本相同，但明顯淡染，部分細(xì)胞中可見著色顆粒。見圖5。

圖3 正常胎盤組織中Klotho 蛋白的表達(dá)

圖4 正常胎盤組織中Klotho 蛋白的表達(dá)

圖5 重度子癇前期胎盤組織中Klotho 蛋白的表達(dá)

2.5 兩組Klotho 蛋白在母血和臍血中的含量比較

Klotho 蛋白在對照組母血中含量為(233.80±117.20)pg/mL，在試驗組母血中含量為(148.97±68.80)pg/mL，試驗組低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)；Klotho 蛋白在對照組臍血中含量為(121.47±22.85)pg/mL，試驗組臍血中含量為(62.73±28.86)pg/mL，試驗組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。見表3。

表3 兩組Klotho蛋白在母血和臍血中的含量比較

2.6 母血及臍血中Klotho 蛋白含量的ROC 曲線值

根據(jù)母血、臍血Klotho 蛋白濃度及血Ca濃度繪制其ROC 曲線，計算曲線下面積(AUC)，發(fā)現(xiàn)臍血中Klotho 蛋白含量AUC 值大于0.6，對重度子癇前期有一定的預(yù)測意義，當(dāng)Klotho 蛋白濃度為75.69 pg/mL 時，其曲線下面積為0.818，其靈敏度為100%，特異度為58.3%，而母血中Klotho 蛋白含量的AUC 值小于0.6，無明顯診斷價值。見表4。

表4 母血及臍血中Klotho 蛋白含量的ROC 曲線值

2.7 兩組孕婦妊娠并發(fā)癥及結(jié)局比較

試驗組發(fā)生子癇1 例，低白蛋白血癥16 例，ICP 8 例，肝功能異常5 例，F(xiàn)GR 6 例，胸腔積液1 例，肺動脈高壓1 例，平產(chǎn)2 例，剖宮產(chǎn)41 例，產(chǎn)后出血1 例。對照組并發(fā)低白蛋白血癥2 例，ICP 3 例，肝功能異常1 例，F(xiàn)GR 0 例，平產(chǎn)31 例，剖宮產(chǎn)9 例，產(chǎn)后出血1 例。試驗組發(fā)生低白蛋白血癥率、FGR 率高于對照組，剖宮產(chǎn)率亦增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。兩組孕婦發(fā)生子癇、腦血管意外、ICP、肝功能異常、胎盤早剝、視網(wǎng)膜病變、胸腔積液、肺動脈高壓、產(chǎn)后出血及產(chǎn)褥感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。究其原因，這可能與妊高病基本病理生理改變引起宮內(nèi)胎兒、胎盤變化有關(guān)。見表5。

表5 兩組孕婦妊娠并發(fā)癥及結(jié)局比較[n(%)]

2.8 兩組新生兒一般情況和結(jié)局比較

試驗組發(fā)生FGR 6 例，早產(chǎn)15 例，新生兒死亡1例。試驗組新生兒出生體重及胎齡均小于對照組，新生兒Apgar 1 min 評分低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)，兩組新生兒窒息及死亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。見表6。

表6 兩組新生兒一般情況和結(jié)局比較

2.9 Klotho 蛋白及血Ca2+與妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)兒結(jié)局的相關(guān)性分析

對母血及臍血Klotho 蛋白濃度、血Ca濃度與妊娠結(jié)局進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，母血Klotho 蛋白濃度與血壓呈負(fù)相關(guān)，臍血Klotho 蛋白濃度與分娩孕周呈正相關(guān)，血Ca濃度與分娩孕周呈正相關(guān)，與血壓、低白蛋白血癥、及胸腹水的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)，母血、臍血Klotho 蛋白濃度及血Ca濃度與其他妊娠結(jié)局無明顯相關(guān)性。見表7，說明Klotho蛋白濃度及血Ca濃度與妊娠結(jié)局有一定的關(guān)系，對于不良妊娠結(jié)局的預(yù)測有一定的意義。

表7 Klotho蛋白及血Ca2+與妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析(r/P)

對母血及臍血Klotho 蛋白濃度與圍產(chǎn)兒結(jié)局進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，臍血Klotho 蛋白濃度與胎齡呈正相關(guān)，與早產(chǎn)的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，血Ca與胎齡呈正相關(guān)，與胎兒生長受限及早產(chǎn)的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。見表8。

表8 Klotho蛋白及血Ca2+與圍產(chǎn)兒結(jié)局的相關(guān)性分析(r/ρ)

3 討 論

Klotho 蛋白是一種高表達(dá)于腎臟與大腦的抗衰老蛋白，其參與心血管疾病、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激氧化失衡等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。大量研究中顯示Klotho蛋白的低表達(dá)可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管生成受損，類似于衰老的血管，從而加快動脈粥樣硬化、高血壓的發(fā)展。Klotho 蛋白參與血壓調(diào)節(jié)及保護(hù)血管確切機(jī)制尚不明確，可能從以下幾點降低血壓從而發(fā)揮保護(hù)心血管系統(tǒng)：(1)Klotho 蛋白可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生一氧化氮，減緩血壓升高，預(yù)防血管纖維化及血管內(nèi)膜肥厚，通過血清NO 機(jī)制參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展；(2)Klotho蛋白可減少過氧化氫所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和衰老以增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性；(3)Klotho 蛋白通過抑制Wnt/βCatenin 途徑參與調(diào)節(jié)多個腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因，從而參與血壓的調(diào)節(jié)。

目前，Klotho 蛋白在胎盤中的具體作用機(jī)制尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)，Klotho 蛋白主要定位于合胞滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛結(jié)締組織間隙，在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中也有少量表達(dá)，這與Loichinger研究一致。Klotho 蛋白似乎是一個潛在的重度子癇前期標(biāo)記物，具有較高的敏感性和特異性。由于子癇前期是一種胎盤源性疾病，而人Klotho蛋白可能通過與重度子癇前期相關(guān)的不同途徑發(fā)揮作用。本實驗中，研究發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白在試驗組胎盤中表達(dá)低于對照組，這可能與Klotho 蛋白通過血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮、抗氧化酶以及新生血管生成有關(guān)，從而對內(nèi)皮功能障礙產(chǎn)生保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期患者血管平滑肌細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流可能是導(dǎo)致低血鈣及平滑肌細(xì)胞痙攣性收縮的重要原因，在PE 的病理過程中起重要作用。Chen發(fā)現(xiàn)額外的鈣處理阻止了由低鈣引起的內(nèi)皮細(xì)胞活化，鈣治療前可防止暴露于壞死滋養(yǎng)細(xì)胞碎片、IL-6 或子癇前期絲氨酸引起的內(nèi)皮細(xì)胞活化。因此，對于Ca導(dǎo)致重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究，有助于為SPE 的防治提供新的思路和靶點。

新的研究發(fā)現(xiàn)，尿鈣排泄及磷的重吸收與Klotho 蛋白的降低有關(guān)。基礎(chǔ)研究也表明，小鼠Klotho基因敲除后不僅壽命縮短，還出現(xiàn)有高磷高鈣血癥、血管及軟組織鈣化等一系列鈣磷代謝紊亂癥狀，這說明Klotho 蛋白對血鈣具有調(diào)節(jié)作用。Klotho 蛋白調(diào)節(jié)血鈣的機(jī)制可能有：(1)Klotho 蛋白可以作為FGF-23 的共受體，通過FGF-23 依賴性的機(jī)制調(diào)控鈣磷代謝；(2)Klotho 蛋白可以通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，抑制血管平滑肌細(xì)胞向骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制鈣鹽沉積；(3)Klotho 蛋白通過調(diào)控小管上皮細(xì)胞鈣通道(transient rec eptor potential vanilloid 5，TRPV5) 活性從而促進(jìn)鈣的重吸收，抑制鈣排泄；(4)Klotho 蛋白可調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣離子以調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的鈣超載，這可能與VEGF 及腎上皮細(xì)胞表面TRPV5 介導(dǎo)的細(xì)胞鈣內(nèi)流有關(guān)。

本研究中，試驗組胎盤中Klotho 蛋白的表達(dá)高于對照組，臍血中Klotho 蛋白含量低于正常對照組，血Ca亦低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)臍血中Klotho 蛋白含量在ROC 曲線中的AUC 值為0.818，大于0.6，其靈敏度為100%，特異度為58.3%，對SPE 有一定的預(yù)測意義，而母血中Klotho 蛋白含量在ROC 曲線中的AUC 值為0.554，小于0.6，無明顯診斷價值，血Ca預(yù)測SPE 的曲線下面積為0.663，當(dāng)Ca＜2.09 mmol/L 時，其預(yù)測SPE 的靈敏度為87.4%，特異度為42.1%。

對母血及臍血Klotho 蛋白濃度、血Ca濃度與妊娠結(jié)局進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，母血Klotho 蛋白濃度與血壓呈負(fù)相關(guān)，臍血Klotho 蛋白濃度與分娩孕周呈正相關(guān)，對母血及臍血Klotho 蛋白濃度與圍產(chǎn)兒結(jié)局進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，臍血Klotho 蛋白濃度與胎齡呈正相關(guān)，與早產(chǎn)的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，血Ca與胎齡呈正相關(guān)，與胎兒生長受限及早產(chǎn)的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。SPE 孕婦胎盤中Klotho 蛋白的表達(dá)低于對照組，臍血中含量低于正常對照組，Klotho 蛋白與SPE 的發(fā)生有一定的關(guān)系。母血血Ca、臍血中Klotho蛋白濃度的降低是發(fā)生SPE 的高危因素，血Ca、母血及臍血中Klotho 蛋白濃度與妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)兒結(jié)局有一定的相關(guān)性，對SPE 的預(yù)測、診斷有一定的意義。

綜上所述，Klotho 蛋白及Ca與重度子癇前期的發(fā)生有一定的關(guān)系，本研究為重度子癇前期的診治提供了新的方向。但由于樣本量及實驗條件的限制，Klotho 蛋白調(diào)控重度子癇前期的確切分子機(jī)制未深入研究，有待進(jìn)一步探索。