2株廣西鵝源基因XII型新城疫病毒的病原學分析

曾婷婷，謝芝勛*，華俊，謝麗基*，李孟，黃嬌玲，張民秀，張艷芳，苑亞東，撒薇

（1廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧530001；2廣西大學養(yǎng)禽與禽病學研究所，廣西南寧530004）

0 引言

【研究意義】禽1型副黏病毒（1，APMV-1）又稱新城疫病毒（Newcastle disease Viruses，NDV），在世界范圍內(nèi)能感染家禽或鳥類250多種（Amarasinghe et al.，2018），尤其是強毒株感染家禽特別是雞和火雞后表現(xiàn)為羽毛蓬松、腹瀉、食欲廢絕、癱瘓甚至死亡，死亡率高達100%。目前，由于NDV疫苗的推廣應用，在雞、鴨、鵝等家禽上已鮮有新城疫（Newcastle disease，ND）暴發(fā)，但鴿子ND暴發(fā)時有報道，且NDV宿主廣泛、可在不同宿主間互相傳播，全球范圍內(nèi)不斷出現(xiàn)NDV新基因型毒株（Dimitrov et al.，2019）。因此，仍需密切監(jiān)測NDV的流行分布情況，為科學防控ND疫情提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】根據(jù)基因組長度，NDV可劃分為兩大分支：Class I和Class II（Czeglédi et al.，2006）。其中，Class I基因組長度為15198 nt，Class II則包含2種長度，分別是15186和15192 nt。每個分支又細分為若干基因型。根據(jù)Diel等在2012年提出的分類系統(tǒng)中，宜利用F基因全長編碼序列描繪系統(tǒng)發(fā)生樹，至2019年NDV基因分型系統(tǒng)得到進一步優(yōu)化。Class I NDV包含1個基因型，下分3個基因亞型：1.1.1、1.1.2和1.2；Class II NDV包含I～XXI共21個基因型（Dimitrov et al.，2019）。不同基因型NDV具有一定的地域分布特征（Dimitrov et al.，2016），我國境內(nèi)的流行毒株是以感染雞、鴨、鵝等家禽為主的基因VII型（Liu et al.，2003；Qin et al.，2008）和感染鴿子為主的基因VI型（Guo et al.，2013；Xue et al.，2017）。由于家禽生產(chǎn)中廣泛使用疫苗，近十年來已很少出現(xiàn)基因VII型病例，但鴿子感染基因VI型NDV病例的報道較多（Wei et al.，2018；He et al.，2020）。class II基因XII型NDV于2004年首次在南美洲發(fā)現(xiàn)（Chumbe et al.，2017），隨后2008年在越南被分離鑒定（Xuyen et al.，2018），2010年在我國廣東和福建活禽市場監(jiān)測中也分離到基因XII型NDV（劉華雷等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】2018年本課題組在廣西分離鑒定出2株鵝源基因XII型NDV（曾婷婷等，2020），但其生物學特性，以及與其他省份分離株的親緣關系均有待進一步探究?！緮M解決的關鍵問題】通過對2株分離株進行致病性試驗、全基因組測序，并分析主要毒力基因的氨基酸差異位點及遺傳進化關系，以期為NDV流行分布的系統(tǒng)監(jiān)測和ND的科學防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年通過SPF雞胚從廣西活禽市場銷售鵝的咽/泄殖腔拭子中分離獲得2株基因XII型NDV（曾婷婷等，2020），分別命名為Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室自行孵化至9～11日齡。核酸抽提試劑盒EasyPureViral DNA/RNA Kit、膠回收試劑盒EasyPureQuick Gel Extraction Kit及載體連接試劑盒pEASY-Blunt Cloning Kit購自北京全式金生物技術股份有限公司；雙鏈cDNA合成試劑盒Prime-ScriptDouble Strand cDNA Synthesis Kit、高保真RT-PCR試劑盒PrimeScriptII High Fidelity One Step RT-PCR Kit及末端序列擴增試劑盒SMARTer RACE 5'/3'Kit購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 病毒純化

根據(jù)趙明等（2014）的方法，連續(xù)進行4個代次的病毒噬斑純化。當DF-1細胞鋪滿6孔細胞板95%底部時，以PBS清洗2次。以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基對原代病毒液進行10倍梯度稀釋至原濃度的10倍，每個濃度分別接種至6孔細胞板中，置于37℃、5% CO培養(yǎng)箱孵育2 h。孵育完成后吸凈病毒液并以PBS清洗2次，然后覆蓋含1%胎牛血清及1%低熔點瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基（2 mL/孔）。待瓊脂完全凝固，置于37℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，再覆蓋含0.02%中性紅、1%胎牛血清及1%低熔點瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基（2 mL/孔），12～24 h后觀察挑斑。挑取輪廓清晰，與其他噬斑距離較遠，且大小與大多數(shù)噬斑相似的噬斑2個，置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中漩渦振蕩1 min并凍融2次后作為下一代噬斑純化的母液。連續(xù)純化4個代次后，接種SPF雞胚增殖病毒，收獲尿囊液備用，并參照廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室建立的檢測方法排除其他禽副黏病毒（謝志勤等，2017）。

1.3 致病性試驗

根據(jù)GB/T 16550—2008《新城疫診斷技術》的步驟進行致死雞胚平均死亡時間（MDT）和腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）試驗，測定2株分離株的致病性。

1.3.1 MDT操作步驟使用無菌生理鹽水將新鮮尿囊液稀釋為10～10，每個稀釋度取0.1 mL，經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚9日齡的SPF雞胚，8 h后以同樣的尿囊液再接種1次，所有接種雞胚置于37℃下繼續(xù)孵化培養(yǎng)。雞胚連續(xù)觀察7 d，每天觀察2次，記錄雞胚死亡時間和死亡數(shù)量。

式中，、為或小時死亡的SPF雞胚數(shù)（枚），、為雞胚死亡時間（h），為SPF雞胚死亡總數(shù)（枚）。

1.3.2 ICPI操作步驟HA≥4 log2的新鮮尿囊液以無菌生理鹽水稀釋10倍，出殼24～40 h的雛雞均經(jīng)腦內(nèi)途徑接種0.5 mL稀釋后的尿囊液。接種后連續(xù)觀察8 d，每天1次，并計分：正常計0分，病雞計1分，死亡計2分（雛雞死亡后每天仍計2分）。

式中，∑s為8 d累計發(fā)病數(shù)（羽），∑d為8 d累計死亡數(shù)（羽），為8 d累計觀察雛雞總數(shù)（羽）。

1.4 全基因組測序及分析

根據(jù)核酸抽提試劑盒說明分別抽提2株分離株的總RNA，反轉錄合成雙鏈cDNA后送至澤塔生物科技（上海）有限公司進行測序。由于NDV為單股負鏈RNA病毒，二代測序無法直接獲得病毒基因組5'端和3'端50～100 nt序列，因此分別使用5'端引物（5'-TTCTGTTTCCCTGCAAGGG-3'）和3'端引物（5'-GTGCTCAACAAAAATTCTAC-3'）配合末端序列擴增試劑盒提供的通用引物，以2株分離株RNA為模板進行RT-PCR擴增，擴增片段克隆后送至深圳華大基因股份有限公司測序。

1.5 主要抗原蛋白氨基酸序列比對及遺傳進化分析

使用DNASTAR比對2株分離株與南美分離株（基因XIIa亞型）、越南分離株（基因XIId亞型）及我國廣東分離株（基因XIIb亞型）（表1）的主要抗原蛋白（F蛋白和HN蛋白）氨基酸序列，計算F基因核苷酸序列相似性，并使用MEGA X的最大似然法（Maximum likelihood method），基于F基因核苷酸序列相似性構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Kumar et al.，2018），設1000次自展（Bootstrap）驗證。同時，以MEGA X的Maximum Composite Likelihood計算各毒株間的遺傳距離，并通過Gamma Distribution計算每個位點的變異率（Diel et al.，2012）。

2 結果與分析

2.1 病毒純化及致病性

經(jīng)過DF-1細胞4個代次的噬斑純化，分別獲得2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）的純化株。純化株接種SPF雞胚收獲的尿囊液-30℃保存，作為后續(xù)試驗的母液。致病性試驗結果顯示，2株分離株的MDT分別為54和48 h，ICPI分別為1.65和1.65，表明這2株NDV均為強毒株。

2.2 全基因序列測定結果及基因組基本結構

使用DNASTAR將測序獲得的序列與RT-PCR擴增的5'端和3'端序列拼接成完整的NDV全基因組，然后上傳至GenBank，獲得序列號分別為MZ306224和MZ306223。2株分離株的基因組長度均為15192 nt，與我國廣東分離的基因XII型NDV基因組結構（王靜靜等，2018）一致，基因組3'端引導序列為55 nt，5'端尾隨序列為114 nt，NP基因-P基因、P基因-M基因、M基因-F基因、F基因-HN基因、HN基因-L基因的間隔區(qū)分別為1、1、1、31和47 nt（圖1）。

2.3 F基因遺傳進化分析結果

截取2株分離株的F基因全長序列，使用DNASTAR計算其核苷酸序列相似性。結果顯示，2株分離株的F基因核苷酸序列相似性為99.9%，與我國廣東分離株的相似性為97.9%～99.3%，與南美分離株的相似性為90.9%～92.1%，與越南分離株的相似性為91.3%～92.8%。根據(jù)MEGA X計算F基因遺傳距離及構建系統(tǒng)發(fā)生進化樹，結果顯示，2株分離株與我國廣東分離株處于同一分支上，遺傳距離介于0.0174～0.0220；與南美分離株（XIIa亞型）的遺傳距離介于0.0911～0.1150，與越南分離株（XIId亞型）的遺傳距離介于0.0801～0.0834。我國分離株與南美分離株的平均遺傳距離為0.0909，與越南分離株的平均遺傳距離為0.0691。根據(jù)Dimitrov等（2019）更新的NDV分類標準：平均遺傳距離介于0.05～0.10，劃為1個基因亞型，大于0.10劃為1個基因型。即2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）均屬于基因XIIb亞型，與我國廣東分離株屬于同一基因亞型。系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）還顯示，我國2010年的分離株、2011年的分離株及2017年后的分離株分別形成3個小分支，南美分離株也具有類似情況，2004—2006年分離株、2008—2009年分離株及2011年后的分離株分別形成3個小分支，提示基因XII型NDV一直處于不斷進化中。

2.4 F蛋白氨基酸序列分析結果

測序結果顯示，2株分離株的F基因全長1662 nt，F(xiàn)蛋白包含553個氨基酸殘基，F(xiàn)蛋白裂解位點均為RRQKRF。與其他基因XII型NDV相比，在F蛋白的信號肽區(qū)域、融合肽區(qū)域、七肽重復區(qū)和跨膜區(qū)共有14個氨基酸差異位點（表2）。信號肽區(qū)域有5個氨基酸差異位點，其中3個為2017年后我國分離株特有的氨基酸差異（I→L、I→V和C→H），1個是我國分離株特有的氨基酸差異（L→E）；融合肽區(qū)域有2個氨基酸差異位點，其中1個是2017年后我國分離株特有的氨基酸差異（I→V）；七肽重復區(qū)有6個氨基酸差異位點，其中3個是我國分離株特有的氨基酸差異（D→N、V→A和T→I），1個是2株廣西分離株特有的氨基酸差異（N→S）?？梢?，氨基酸位點差異與時間推移有關，也提示基因XII型NDV一直處于不斷進化中，與遺傳進化分析結果一致。

2.5 HN蛋白氨基酸序列分析結果

測序結果顯示，2株分離株的HN基因全長1716 nt，HN蛋白包含571個氨基酸殘基。由于已報道基因XII型NDV只有4株毒株（我國廣東分離株2株，南美分離株2株）上傳了HN基因序列，因此以這4株分離株的HN蛋白氨基酸序列為參考序列進行比對分析，結果顯示，2株分離株的HN蛋白存在5個潛在N-糖基化位點（aa119、aa341、aa433、aa481和aa508），缺失aa538 N-糖基化位點，與我國廣東分離株一致。10個唾液酸受體結合位點與4株參考毒株均無差異。在2株南美分離株中，分離株NDV/peacock/Peru/2011同時缺少aa508和aa538 N-糖基化位點，分離株Chicken/Peru/1918-03/603/2008缺少aa508 N-糖基化位點。2株分離株的HN蛋白跨膜區(qū)及抗原中和區(qū)氨基酸序列與我國廣東分離株均一致（表3），其中蛋白跨膜區(qū)的aa27、aa28、aa34、aa41和aa42及 抗原中和區(qū) 的aa263和aa347與南美分離株存在7個氨基酸差異位點（V→I、A→S、V→I、A→T、V→A、K→R和E→D），這些氨基酸差異可能導致NDV的抗原性差異。

3 討論

Class II基因XII型NDV于2004年首次在南美洲被分離獲得（Chumbe et al.，2017），隨后在越南和我國相繼有報道（劉華雷等，2017；Xuyen et al.，2018）。我國分離株此前集中在廣東，本研究中的2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）是廣西首次分離獲得的鵝源基因XII型NDV。盡管致病性試驗結果和F蛋白裂解位點氨基酸測序結果均顯示這2株分離為強毒株，但其宿主鵝并未表現(xiàn)出任何臨床癥狀。我國其他的基因XII型NDV分離株也均分離自肉眼觀測健康的活禽，Xiang等（2020）還研究證實鵝源分離株MK616244可從鵝跨物種水平傳播給雞，人工感染非免疫鵝并未表現(xiàn)任何癥狀，感染非免疫雞則表現(xiàn)出輕微精神沉郁、扭頭癱瘓等神經(jīng)癥狀，但不致死，且癥狀隨時間推移會逐漸減輕耐過。南美分離株（XIIa亞型）和越南分離株（XIId亞型）均對雞群表現(xiàn)出強毒致病性（Chumbe et al.，2017；Xuyen et al.，2018），南美分離株大部分分離自免疫后的雞群，肉雞感染死亡率為4.0%～12.0%，且表現(xiàn)出呼吸困難等臨床癥狀，蛋雞表現(xiàn)為輕微呼吸困難，產(chǎn)蛋量下降，感染死亡率為1.8%（Chumbe et al.，2017）；越南分離株也分離自免疫后的雞群，表現(xiàn)為精神沉郁、腺胃乳頭出血等（Xuyen et al.，2018）?？梢?，在自然感染狀態(tài)下我國分離株對雞群的致病力遠低于南美分離株和越南分離株。

NDV的毒力和抗原蛋白主要為F蛋白和HN蛋白。本研究通過比對分析GenBank已公布基因XII型NDV的F蛋白和HN蛋白氨基酸序列，結果在這些蛋白的主要功能域發(fā)現(xiàn)我國分離株相對于其他國家分離株存在一些獨特的氨基酸差異：F蛋白的信號肽區(qū)域（L→E/M→E），七肽重復區(qū)的HR1（D→N），七肽重復區(qū)的HR3（V→A/T→A），七肽重復區(qū)的HR2（T→I）；HN蛋白的跨膜區(qū)（V→I、S→A、V→I、A→T和V→A），抗原中和區(qū)（K→R和E→D）。前人研究結果證實，F(xiàn)蛋白的主要功能域與其裂解后形成的F1蛋白膜融合活性相關，信號肽區(qū)域、七肽重復區(qū)的HR1和HR2及跨膜區(qū)的氨基酸位點突變均可導致膜融合活性下降，從而降低NDV的感染力和致病力（Sergel-Germano et al.，1994；Reitter et al.，1995；McGinnes et al.，2001；Gravel et al.，2011）。因此，我國分離株（XIIb亞型）與南美分離株（XIIa亞型）、越南分離株（XIId亞型）對雞群自然致病力的區(qū)別是否與這些位點的氨基酸差異有關，亟待應用反向遺傳學進一步探究。此外，我國分離株HN蛋白aa347的改變（E→D）值得關注，該位點的氨基酸突變（E→K）已被證實會造成NDV抗原的顯著差異（Hu et al.，2010），因此E→D是否導致基因XII型NDV與現(xiàn)有疫苗株間的抗原顯著差異，以及是否會降低現(xiàn)有疫苗保護率將是今后的研究熱點。

基于F基因核苷酸序列相似性構建的基因XII型NDV系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）與我國廣東分離株Goose/CH/GD/E115/2017處于同一小分支上，且這一小分支與其他小分支的遺傳距離較遠；F蛋白氨基酸序列比對分析結果顯示，有3個氨基酸位點差異（I→L、C→H和I→V）是這3株分離株所特有，有2個氨基酸差異位點（I→V和N→S）是廣西分離株所特有。說明盡管2011年后一段時間內(nèi)未分離獲得基因XII型NDV毒株，但該病毒并非一過性感染，而是潛伏在某些宿主身上并一直持續(xù)進化。因此，加強對不同宿主攜帶NDV的實時監(jiān)測對分析病毒演化及防控NDV感染家禽至關重要。

4 結論

我國分離株（XIIb亞型）與南美分離株（XIIa亞型）和越南分離株（XIId亞型）在F蛋白和HN蛋白的氨基酸差異可能與其對雞群的致病力差異有關。此外，基因XII型NDV一直處于不斷進化中，而需持續(xù)監(jiān)測該基因型NDV的流行分布情況。