半滑舌鰨細(xì)胞分裂周期蛋白42 基因克隆與結(jié)構(gòu)預(yù)測

劉厚孚，譚靜，胡秀彩，管振國，呂愛軍，通信作者，孫敬鋒

（1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.天津鼎正新興生物技術(shù)有限公司，天津 300383）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國主要的海水經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]，具有活動范圍小，個體大、生長快、營養(yǎng)等級低、食性溫和等性狀優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，半滑舌鰨皮膚潰爛病、腹水癥等病害問題也隨之而來，對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對于半滑舌鰨天然免疫和細(xì)胞分子免疫機(jī)制知之甚少[2-3]。

細(xì)胞分裂周期蛋白42（Cell division cycle 42，Cdc42）屬于小Rho GTPase 家族，與GTP 結(jié)合時處于活化狀態(tài)，與GDP 結(jié)合時處于失活狀態(tài)，是一種具有酶活性的Rho GTP 酶[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，Cdc42 參與多種細(xì)胞功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、控制細(xì)胞極性等[6-7]。迄今，對人和哺乳動物研究表明，Cdc42基因與疾病和機(jī)體免疫應(yīng)答密切相關(guān)，包括癌癥、艾滋病等多種疾病發(fā)生，且參與免疫與炎癥反應(yīng)[8-9]。BURBAGE 等研究發(fā)現(xiàn)Cdc42是B 細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，是抗病毒體液免疫所必需的因子[10]；HADDAD 報(bào)道Cdc42與WASP之間相互作用引導(dǎo)SDF-1 誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞趨化[11]；WESTERBERG 等研究表明，Cdc42、Rac1 和Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白參與B 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)[12]；王緣等[13]在小鼠巨噬細(xì)胞中特異性敲除Cdc42基因，并使用LBS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率增高，證實(shí)Cdc42在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

在水產(chǎn)動物中，針對Cdc42基因克隆及表達(dá)分析的研究鮮有報(bào)道[5,14]。關(guān)于半滑舌鰨Cdc42的功能研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以半滑舌鰨為研究對象，對其皮膚細(xì)胞分裂周期蛋白42 基因進(jìn)行克隆，并對其基因編碼序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，為今后深入研究Cdc42基因功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）取自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，體重平均（110±10）g，取其皮膚組織立即投入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA 提取。RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix、PCR Buffer 體系購自TaKaRa 公司，DNA Marker、UNIQ-10 柱式膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)半滑舌鰨Cdc42基因編碼序列（登錄號：XM_008320479.3），用生物軟件Primer5.0 設(shè)計(jì)1對特異性引物（表1），引物由蘇州金唯智生物有限公司合成。

表1 Cdc42 的特異性引物

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成

參照HUSAIN 等[15]的提取方法，使用TRIzol Reagent 試劑提取半滑舌鰨皮膚組織的總RNA，并分別加入氯仿、異丙醇和乙醇，離心、震蕩、棄去上清液等。使用超微量分光光度計(jì)測量提取的總RNA 濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。以提取的總RNA 為模板，用TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成cDNA。合成的cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3CsCdc42基因克隆

參照舒歡歡等[16]的克隆步驟進(jìn)行試驗(yàn)，用25μL 體系擴(kuò)增半滑舌鰨皮膚的Cdc42基因。反應(yīng)體系具體為：Cdc42基因DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，無菌超純水11 μL，2×Taq PCR Mix 10μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，30 個循環(huán)；72℃延伸5 min。使用1%瓊脂糖PCR 檢測，切膠回收，并與pMD18-T 載體連接、轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α 后，挑選陽性單克隆菌液送到天津金唯智生物工程有限公司測序。

1.2.4CsCdc42基因序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測

參照譚靜等[17]的文獻(xiàn)進(jìn)行。采用ORF 程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找序列的開放閱讀框，利用在線分析軟件EXPASY、PHYRE2、SMART 和PSIPRED 進(jìn)行生物信息分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，用DNAStar 軟件進(jìn)行基因蛋白抗原性、親水性等理化特性分析，用ClustalW 及MEGA 7.0 進(jìn)行序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨CsCdc42 基因克隆

以半滑舌鰨皮膚組織cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴(kuò)增Cdc42基因得到目的條帶，并與預(yù)期片段大小一致（圖1）。切膠回收、將其亞克隆至pMD18T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 后、挑選pMD18T-Cdc42 陽性克隆基因測序，測序獲得半滑舌鰨Cdc42目的基因序列及其引物（圖2），命名為CsCdc42。

圖1 半滑舌鰨CsCdc42 基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 半滑舌鰨CsCdc42基因的引物序列

2.2 半滑舌鰨 Cdc42 cDNA 編碼蛋白的序列特征及生物信息學(xué)分析

半滑舌鰨 CsCdc442 基因測序獲得目的基因序列的片段長度為847 bp，推測編碼191 個氨基酸（圖3）。預(yù)測理論等電點(diǎn)（PI）為6.73，分子量為21.26 kD。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測表明，Cdc42基因沒有信號肽，推測 Cddc42 可能不是分泌蛋白。對半滑舌鰨CDc42蛋白跨膜區(qū)分析表明，該蛋白無跨膜區(qū)，說明該蛋白為非跨膜蛋白。親疏水性分析結(jié)果顯示疏水性最小值約為-3.01，最大值約為3.00，，整個多肽鏈中為負(fù)值的氨基酸占多數(shù)，推測CsCdc42 為親水性蛋白（圖4），蛋白平均系數(shù)GRAVY 為-0.195。

圖3 半滑舌鰨CsCdC42 cDNA編碼區(qū)序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖4 半滑舌鰨CsCdc42 親疏水性分析

預(yù)測CsCdc42 含有7 個主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），說明該基因蛋白抗原性良好（圖5）。

圖5 半滑舌鰨CsCdc42 蛋白表面和抗原指數(shù)分析

進(jìn)一步對CsCdc42 蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)CsCdc42 沒有糖基化位點(diǎn)，有多個磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)閾值≥0.5 時共有17 個磷酸化位點(diǎn)，其中8 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（S22/30/70/82/84/89/90/126），6 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（T2/24/25/109/117/161），3 個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)（Y30/64/157）。此外，閾值≤0.5 時，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)主要分布在80-90 aa之間，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)主要分布在20-40 aa 之間，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)在20-40 aa 之間顯著分布（圖6）。

圖6 半滑舌鰨Cdc42 基因的磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 Cdc42 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用Blast 軟件在線搜索結(jié)果顯示，CsCdc42與斑馬魚（Danio rerio，NP_956926.1）的氨基酸同源性最高為99.43%，其次與人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）和青鳉（Oryzias melastigma，XP_024148790.1）分別為98.43%和97.91%，與虹鱒（Oncorhynchus mykiss，ACO08171.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，AWP03434.1）、果蠅（Drosophila willistoni，XP_002075304.1）、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、雙斑蛸（Octopus bimaculoides，XP_014784384.1）的同源性分別為95.81%、94.76%、93.19 %、91.10%、91.10%。進(jìn)行CsCdc42基因氨基酸多重序列對比分析，發(fā)現(xiàn)在人、斑馬魚、青鳉、果蠅等模式生物以及多種水產(chǎn)動物中，Cdc42 蛋白序列含有RHO 結(jié)構(gòu)域、ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)3個高保守區(qū)域，這可能與細(xì)胞分裂周期蛋白功能有關(guān)（圖7）。從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載人、斑馬魚、大菱鲆、青鳉、虹鱒等17 個Cdc42相關(guān)基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，CsCdc42與斑馬魚（Danio rerio，NP 956926.1）、人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，KAF0035709.1）、青鳉（Oryzias latipes，XP 011475757.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，XP 021472057.1）親緣關(guān)系最近，自然聚為一支；與南美白對蝦（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、果蠅（Drosophila melanogaster，AAD43792.1）親緣關(guān)系較近；與南極鱈（Notothenia coriiceps，XP_010773360.1）、雜色鳉（Cyprinodon variegatus，XP_015226325.1）、斗魚（Betta splendens，XP_029023734.1）、鯽（Carassius auratus，XP_026109495.1）等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聚為另一支（圖8）。

圖7 不同物種Cdc42 氨基酸序列多重比對分析

2.4 半滑舌鰨Cdc42 結(jié)構(gòu)預(yù)測

對半滑舌鰨Cdc42 結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，Cdc42只有一個RHO 結(jié)構(gòu)域，氨基酸位點(diǎn)在6-179 aa。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測α 螺旋占30.9%、β 折疊占24.6%、無規(guī)則卷曲占44.5%，說明Cdc42 主要由α 螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖9A）；由三級結(jié)構(gòu)預(yù)測可以看出CsCdc42 是一個球形蛋白質(zhì)（圖9B）并且和二級結(jié)構(gòu)結(jié)果基本一致，同時預(yù)測在氨基酸10-18 aa 為CsCdc42 的ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)，在54-60 aa 為CsCdc42 的?；稽c(diǎn)（圖9C）。

圖9 Cdc42 基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

迄今為止，對于魚類的Cdc42基因研究相對較少，關(guān)于半滑舌鰨Cdc42功能研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]。胡默儼[14]對草魚Cdc42基因克隆表達(dá)分析，結(jié)果表明Cdc42基因編碼191 個氨基酸，為不穩(wěn)定性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，并只含有一個保守結(jié)構(gòu)域RHO，這與本試驗(yàn)半滑舌鰨CsCdc42基因序列分析結(jié)果基本一致。進(jìn)一步通過Cdc42氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示半滑舌鰨CsCdc42 屬于Rho 超家族酶蛋白家族，而且與斑馬魚、人、青鳉和虹鱒Cdc42親緣關(guān)系最近。此外，預(yù)測半滑舌鰨CsCdc42含有7 個主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），說明該基因蛋白抗原性良好，其抗原保護(hù)性功能值得進(jìn)一步研究。

Cdc42 是Rho 蛋白家族中研究比較深入的成員，可以調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架和各種細(xì)胞黏附，對于機(jī)體發(fā)育與繁殖有重要影響[7]。在對人類和哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)Cdc42與許多器官以及各種疾病密切相關(guān)。LI 等[18]通過將Cdc42-flox 小鼠與肌球蛋白輕鏈（MLC）2a-Cre 小鼠雜交試驗(yàn)，確定Cdc42在心肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞黏附中有重要作用。OLENIK 等[19]通過采用原位雜交和Western blot方法研究Rho GTPases 在成年大鼠大腦中的表達(dá)情況，在海馬神經(jīng)元、齒狀回顆粒細(xì)胞和肺門細(xì)胞中檢測到大量RhoA、RhoB、Rac1 和Cdc42 mrna，Western blot 檢測到海馬、小腦、丘腦和大腦皮層中含有RhoA和Cdc42蛋白，所以認(rèn)為Rho GTPases在大腦細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。ZAN 等人通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測20例食管癌及癌旁正常組織中Cdc42和Rb基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cdc42基因異常表達(dá)影響了食管癌發(fā)生[20]。CHERNICHENKO等[21]通過單個細(xì)胞軌跡分析對鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）進(jìn)行siRNA 篩選，認(rèn)為Cdc42在癌細(xì)胞神經(jīng)侵襲及治療癌癥方面有重要意義。目前，對水產(chǎn)動物的Cdc42基因研究發(fā)現(xiàn)，Cdc42可能對于水產(chǎn)生物防御病原體的細(xì)胞以及分子機(jī)制有重要作用。李麗麗等[5]通過對斑節(jié)對蝦Cdc42基因克隆表達(dá)分析，研究斑節(jié)對蝦在哈維弧菌（Vibrio harveyi）脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cdc42在血淋巴中的表達(dá)較高，并且在哈維弧菌脅迫情況下發(fā)現(xiàn)Cdc42上調(diào)顯著，證明Cdc42可能具有重要免疫調(diào)節(jié)作用；胡默儼[14]在草魚Cdc42克隆試驗(yàn)中，通過熒光定量PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)Cdc42基因在頭腎、中腎、肝、脾等免疫器官中均有不同程度表達(dá)，但Cdc42在水產(chǎn)動物中的具體免疫機(jī)制仍不清楚，值得進(jìn)一步研究。

本研究采用RT-PCR 方法對半滑舌鰨皮膚Cdc42基因進(jìn)行克隆，并對其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，為今后深入研究Cdc42基因功能打下基礎(chǔ)。關(guān)于魚類細(xì)胞分裂周期蛋白42 基因序列特征及其蛋白功能，今后仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究證實(shí)。