五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞毒性效應(yīng)的研究

王紅宇，呂湘琳，聶江力，齊紅莉

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

中草藥是中華民族的瑰寶，具有耐藥性低、藥物殘留少、易降解、低成本、易獲得等諸多優(yōu)點(diǎn)[1-3]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中發(fā)揮重要作用[4-5]，同時(shí)也可作為魚類飼料的添加劑，不僅能起到殺菌作用，而且可以增強(qiáng)魚體免疫力[6-7]。五倍子（Galla Chinansis）是一種傳統(tǒng)中草藥，主要成分為鞣質(zhì)，別名百蟲倉，隸屬于癭棉蚜科（Pemphigidae）五節(jié)根蚜亞科（Fordinae）。被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌類病害防治，例如爛鰓病、水霉病、赤皮病等[8]。

多刺裸腹溞（Moina macrocopa）隸屬于甲殼綱、枝角亞目、裸腹溞屬，是淡水微食物網(wǎng)中的重要組成部分[9]。多刺裸腹溞具有分布范圍廣、生命周期短、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)許多外源性物質(zhì)敏感等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究[10]。近年來，關(guān)于五倍子對(duì)水生生物毒性的研究，主要集中在藻類[11-13]。目前關(guān)于五倍子對(duì)多刺裸腹溞生態(tài)毒性的研究還尚未見報(bào)道。因此，五倍子對(duì)多刺裸腹溞毒性效應(yīng)的研究對(duì)評(píng)價(jià)水生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 多刺裸腹溞的來源和培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的多刺裸腹溞（Moina macrocopa）購于武漢水生生物研究所，置于自然光條件下培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為曝氣自來水，溫度為（25±1）℃。經(jīng)3 代以上孤雌生殖，使其敏感度達(dá)到GB/T13266-91 中的要求。以斜生柵藻（Scenedesmusobliquus）投喂[14]，斜生柵藻購于深圳金普邁生物技術(shù)公司，后期進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 五倍子水提液制備

參照聶江力等的試驗(yàn)方法[11]。

1.3 測定LC50 的急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)周永欣等[15]測定水生生物毒性試驗(yàn)的方法計(jì)算多刺裸腹溞的LC50（半數(shù)致死濃度）。藥物濃度設(shè)置為0、87、100、115、135、155 mg/L，每組3 個(gè)平行。每個(gè)燒杯中放入多刺裸腹溞幼溞10只。在試驗(yàn)開始進(jìn)行后的24 h、48 h 和96 h 分別記錄每個(gè)濃度和對(duì)照組的幼溞死亡數(shù)量，死亡標(biāo)準(zhǔn)為轉(zhuǎn)動(dòng)燒杯，沉到杯底的幼溞15 s 內(nèi)仍不能游動(dòng)視為死亡[10]，根據(jù)概率單位法計(jì)算48-h LC50值[15]。

1.4 生命表試驗(yàn)

生命表試驗(yàn)五倍子水提液的濃度設(shè)置分別是0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和40.00 mg/L，每組3 個(gè)平行，每組平行都使用同一代的幼溞10只，并加入相對(duì)應(yīng)的測試液20 mL，并且試驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂。試驗(yàn)在溫度（25±1）℃、自然光照條件下進(jìn)行。試驗(yàn)開始后要每隔24 h 記錄和觀察每組試驗(yàn)小燒杯中多刺裸腹溞的死亡數(shù)、存活數(shù)以及產(chǎn)出的幼體個(gè)數(shù)，并將還存活的母體繼續(xù)培養(yǎng)，如所產(chǎn)的幼體過多就將母體轉(zhuǎn)移至相同條件、相同新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。生命表試驗(yàn)要等到所有受試的個(gè)體全部死亡時(shí)終止。在體式解剖鏡下觀察幼溞[10]。

1.5 相關(guān)參數(shù)的定義和計(jì)算[16]

世代時(shí)間（T）：指從親代到子代出生所經(jīng)歷的時(shí)間；

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20.0 分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)所得數(shù)據(jù)作正態(tài)性檢驗(yàn)后，對(duì)符合分布的各組數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析（one-way ANOVA）分析各濃度組與對(duì)照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的急性毒性影響

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，87、100、115、135、155 mg/L 的多刺裸腹溞48 h 的死亡率分別為63%、53%、70%、83%和98%，48 h 多刺裸腹溞的死亡率與五倍子水提液濃度呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其回歸方程為Y＝0.006X＋0.022 6，R2＝0.863 9，P＜0.01）；五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的48-h LC50值為79.57 mg/L，95%置信區(qū)間為62.48 mg/L～202.58 mg/L。

2.2 五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞存活率和繁殖率的影響

與對(duì)照組（圖1）相比，其他五倍子水提液濃度組的存活率和繁殖率顯著降低，而各濃度間無顯著差異。由圖2 可知，低濃度組的五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞繁殖率影響明顯高于高濃度組。其中高濃度組（40 mg/L）與對(duì)照組相比，繁殖率顯著降低，多刺裸腹溞在第五天才開始繁殖（圖2），對(duì)照組的多刺裸腹溞在第一天就開始繁殖。而低濃度組的五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞繁殖率的影響不顯著，但隨著藥物作用時(shí)間延長，繁殖率開始逐漸降低。

圖1 對(duì)照組多刺裸腹溞的繁殖率和存活率

圖2 五倍子水提液各濃度組多刺裸腹溞的繁殖率和存活率

2.3 五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)的影響

暴露于不同濃度的五倍子水提液中多刺裸腹溞的生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)見表 1。單因素方差one-way ANOVA 分析結(jié)果表明，各濃度五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的生命期望、世代時(shí)間、內(nèi)稟增長率、平均壽命和凈生殖率有顯著影響（P＜0.05）。與對(duì)照組相比在5、20、40 mg/L 的五倍子水提液下多刺裸腹溞的種群內(nèi)稟增長率顯著降低（P＜0.05）。在濃度為40 mg/L的五倍子水提液中，多刺裸腹溞的凈生殖率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 不同濃度五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)的影響

3 討論

半數(shù)致死濃度LC50是判斷被測試生物對(duì)所用藥物敏感程度較為直觀的指標(biāo)[16-19]。本研究中五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的急性毒性48-h LC50為79.57 mg/L。有研究發(fā)現(xiàn)，五倍子水提液在低濃度（50 mg/L）下對(duì)銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）的抑制率達(dá)到50%[11]，這表明五倍子具有可作為水華控制藥物的巨大潛力。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硝化菌劑對(duì)多刺裸腹溞的急性毒性48-h LC50為1.00×1022mg/L[20]，這表明多刺裸腹溞對(duì)硝化菌劑的敏感性遠(yuǎn)低于五倍子水提液，因此可推測五倍子更適合作為水環(huán)境調(diào)控的“生態(tài)制劑”。其他研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子對(duì)魚源弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）的最低殺死細(xì)菌濃度為125 mg/mL，顯著低于本試驗(yàn)的研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)五倍子可被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌病害的防治[21]。

生命表是可以直觀而簡單反應(yīng)出種群存活和死亡過程的統(tǒng)計(jì)表，在人口學(xué)和生態(tài)學(xué)中又稱死亡表或壽命表，它是一種根據(jù)特定人群年齡組死亡率數(shù)據(jù)記錄匯總而編制的統(tǒng)計(jì)表，是對(duì)一定數(shù)量的人口從出生到死亡過程的一種記錄[22]。枝角類繁殖和種群生長受藥物的種類和濃度影響。本研究中，高濃度組的五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的內(nèi)稟增長率和凈生殖率有顯著影響（P＜0.05）。這與劉曉偉等對(duì)百草枯和草甘膦對(duì)多刺裸腹溞的毒性效應(yīng)研究結(jié)果基本一致[10]；本研究發(fā)現(xiàn)，五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)中的生命期望、世代時(shí)間和凈生殖率三個(gè)指標(biāo)相對(duì)影響較低，這與張根等研究的鉬對(duì)多刺裸腹溞的生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)的影響結(jié)果基本一致[23]；本研究發(fā)現(xiàn)，以斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）為食的多刺裸腹溞在五倍子水提液濃度為5 mg/L 時(shí)，生命期望顯著延長，其他研究結(jié)果顯示，藥物濃度為0.1 和1.0 μg/L 的β-六六六顯著提高了以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為食的多刺裸腹溞的種群內(nèi)稟增長率，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果基本一致[24]，推測可能由于藻類吸收了一部分藥物，導(dǎo)致作用于多刺裸腹溞的濃度降低，然而關(guān)于五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）通過本試驗(yàn)得出，五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的48-h LC50為79.57mg/L，95%置信區(qū)間為62.48 mg/L～202.58 mg/L。

（2）生命表試驗(yàn)中，五倍子水提液對(duì)多刺裸腹溞的生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)均有一定影響，其中對(duì)種群內(nèi)稟增長率和凈生殖率具有顯著影響。