環(huán)己烷萃取-微波消解-原子熒光光譜法測定白米中硒含量的方法研究

盧 鑫，張 琳

(濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)護(hù)理學(xué)院，河南 濟(jì)源 459000)

硒作為人體健康所必需的微量元素之一，直接作用于機(jī)體的代謝過程，而有機(jī)硒如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等還具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等生理活性，因此硒也被譽(yù)為生命的“火種”。宋嬋娟在文章中提出膳食中補(bǔ)充富硒酵母，可使癌癥發(fā)病率和死亡率下降50%左右[1]。目前，全球有40多個國家或地區(qū)處于低硒或缺硒狀態(tài)[2]，因此，近年來富硒稻米、富硒核桃、富硒小麥、富硒蘋果等食品的研制開發(fā)[3-5]，使硒元素日益成為人們和社會關(guān)注的熱點(diǎn)。

食物補(bǔ)硒是當(dāng)前最便利、也是最被廣泛推崇的方法，但食物中硒分為無機(jī)硒和有機(jī)硒兩類。無機(jī)硒如硒酸鹽、亞硒酸鹽、揮發(fā)態(tài)的甲基硒和硒化氫等毒性大、生物利用率低；有機(jī)硒如硒蛋白、硒代蛋氨酸等多為硒與不同氨基酸結(jié)合的大分子氨基酸或是硒代氨基酸的衍生物，由此形成的有機(jī)態(tài)的硒化物，不僅毒性小，而且生物利用率高，更為重要的是安全性高[6-7]。當(dāng)前市面上的富硒食品涉及種類多，包括蔬菜、水果和保健食品等，但因其存在的價態(tài)和形態(tài)不同，不同類富硒食品中具有的生物活性也相差較大。隨著我國人民生活水平不斷提高，市場上富硒食品越來越多，為了讓消費(fèi)者真正享受富硒食品的保健效果，對食品中硒含量及硒形態(tài)的分析顯得尤為重要。

目前，測定硒含量多用儀器分析的方法，主要有原子熒光光譜法、比色法和原子吸收法，近年來電感耦合等離子體質(zhì)譜法、高效液相色譜法等也用于硒含量的測定[8-10]。其中，氫化物-原子熒光光譜法具有靈敏度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，并且試劑毒性小、實(shí)用性強(qiáng)，開始被廣泛使用。

為探索研究運(yùn)用原子熒光光譜法對當(dāng)?shù)厮a(chǎn)的富硒白米進(jìn)行檢測，試驗(yàn)將采用正交試驗(yàn)對儀器檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，對樣品的提取分離條件、前處理方法進(jìn)行研究，最終建立測定白米中硒種類和含量的方法，從而實(shí)現(xiàn)對當(dāng)?shù)禺a(chǎn)白米中無機(jī)硒和有機(jī)硒含量的快速測定。

一、試驗(yàn)材料與方法

(一)試劑與材料

富硒白米取自濟(jì)源五龍口鎮(zhèn)西正村富硒米，其他材料為：硝酸(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、高氯酸(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、過氧化氫(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、氫氧化鈉(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲苯(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、環(huán)己烷(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、硼氫化鉀(分析純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司)、鐵氰化鉀(分析純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司)；Se標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、高純氬氣，試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

(二)主要儀器

試驗(yàn)采用的儀器主要為：RGF-6300原子熒光光度計(jì)(北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司)、MD6C-6H型微波消解儀(維克特銳(北京)科技有限公司)、趕酸儀(北京東航科儀有限公司)、FA2204B萬分之一天平(上海精密儀器儀表有限公司)、電熱恒溫水浴鍋、超聲波清洗器、粉碎機(jī)、電熱板。

(三)正交試驗(yàn)用溶液配制

準(zhǔn)確移取10.00 mL質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容100 mL，搖勻，即得100 μg/mL溶液；移取該溶液5 mL，用超純水定容至100 mL，即為5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(四)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的配制

準(zhǔn)確移取10.00 mL質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容100 mL，搖勻，即得100 μg/mL溶液；從中分別移取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，2 mL、4 mL、8 mL、10 mL至100 mL容量瓶中，采用體積分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸溶液定容，稀釋后溶液質(zhì)量濃度分別為1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL，依次做好標(biāo)簽標(biāo)記后待用。

(五)樣品處理

將富硒大米在超純水中清洗后，放置于65 ℃的烘箱中烘干，冷卻至室溫后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過篩(20目篩)，將過篩后的樣品置于干燥的塑料瓶中備用。

1.消解樣品

濕法消解：精確稱取上述制備好的樣品0.8 mg置于250 mL錐形瓶中，加入硝酸-高氯酸(體積比為4∶1)的混合溶液，瓶口處放置一彎頸小漏斗，進(jìn)行冷消化過夜，24 h后置于電加熱板上加熱消化，若過程中酸液減少，可進(jìn)行適量補(bǔ)加，再對其加熱至冒白煙，濃縮至小體積，至不可蒸干為止，取下冷卻后加入5 mL摩爾濃度為 6 mol/L的鹽酸溶液，再置于電加熱板上加熱至白煙冒出，至溶液呈現(xiàn)清亮無色狀態(tài)，取出冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL比色管，加入1.5 mL鐵氰化鉀溶液，用水定容至25 mL，混勻備用，用于檢測總硒含量。同時，同樣方法和步驟進(jìn)行空白試驗(yàn)。

微波消解：精確稱取 0.8 mg 樣品于消解管中，依次加水30 mL，過氧化氫2 mL、硝酸8 mL，振搖混合均勻后，于微波消解儀中按設(shè)定程序(見表1)進(jìn)行消解，微波消解結(jié)束冷卻后轉(zhuǎn)入錐形瓶中，再進(jìn)行加熱趕酸，至不可蒸干為止，冷卻后加6 mol/L的鹽酸溶液5 mL，沸水浴15 min后至溶液呈現(xiàn)清亮無色狀態(tài)，并同時伴有白煙，冷卻至室溫后引流轉(zhuǎn)移至25 mL比色管，再加入1.5 mL鐵氰化鉀溶液混勻，加水定容至25 mL，搖勻備用，用于檢測總硒含量。同時，做空白試驗(yàn)。

表1 微波消解儀設(shè)置條件

2.無機(jī)硒萃取

稱取0.8 mg樣品，加超純水30 mL搖勻，水浴超聲浸提25 min后，再進(jìn)行85 ℃的水浴10 min，適時補(bǔ)加水，冷卻后，用1.25 mol/L的NaOH溶液，將pH值調(diào)至為7.0～7.5，之后過濾。將濾液置于分液漏斗中，加入環(huán)己烷，振蕩萃取，將水相按照表1微波消解處理、備用，用于檢測無機(jī)硒含量。

(六)樣品上機(jī)檢測和計(jì)算公式

檢測前先開機(jī)通入氬氣，設(shè)定好各項(xiàng)參數(shù)后預(yù)熱 30 min，用體積分?jǐn)?shù)為 5%鹽酸作載流，8%的硼氫化鉀溶液和質(zhì)量濃度為5 g/L的NaOH溶液做還原劑測定。計(jì)算公式：X=(C-C0)×V/m。

式中：X—樣品中硒的質(zhì)量比(μg/g)；C—樣品消化液測定的濃度(μg/mL)；C0—樣品空白消化液測定濃度(μg/mL)；m—樣品稱量質(zhì)量(g)；V—樣品預(yù)處理后定容的總體積(mL)。根據(jù)差減法算出有機(jī)硒質(zhì)量比，即有機(jī)硒=總硒-無機(jī)硒。

二、結(jié)果與討論

(一)儀器檢測條件優(yōu)化

使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇儀器條件，分別定義A為光電倍增管的負(fù)高壓，包含 280、290、300三個水平；定義B為燈電流，包含60、70、80三個水平，定義 C 為載氣流量，包含 300、400、500三個水平，定義 D 為屏蔽氣流量，包含 900、1000、1100三個水平，建立4因素3水平的 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，用5 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 L9(34)儀器檢測條件正交表試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表2可知，影響測定結(jié)果中熒光強(qiáng)度的因素由大到小順序?yàn)樨?fù)高壓>燈電流>載氣流量>屏蔽氣流量。最優(yōu)條件為A3B3C2D1，結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果最終選擇測試硒元素的最優(yōu)條件為：負(fù)高壓300 V、燈電流80 mA、原子化爐高度8 mm、原子化溫度200 ℃、載氣流量400 mL/min、屏蔽氣流速900 mL/min、延時時間1.0 s、讀數(shù)時間10 s。在此條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和樣品測試。

(二)樣品前處理的優(yōu)化

1.消解方法的比較

在上述最優(yōu)工藝條件下，探討了濕法消解和微波消解的優(yōu)劣，結(jié)果見表3。由表3可見，3次平行測定中，微波消解比濕法消解測定的結(jié)果高且重現(xiàn)性好，濕法消解中料液比對消解有影響，在一定的硝酸-高氯酸混合溶液范圍內(nèi)料液比的影響不大，說明濕法消解會對消解的完全程度有影響；微波消解采用了密閉溶樣罐及微波加熱的方式，有利于試樣的消化，且硒損失較少，結(jié)果更準(zhǔn)確，故樣品測定采取微波消解方式。

表3 濕法消解和微波消解試驗(yàn)結(jié)果 μg

2.環(huán)己烷萃取次數(shù)的優(yōu)化

大米中有機(jī)硒多是與蛋白質(zhì)結(jié)合的不溶性大分子化合物，而少量沒有與蛋白質(zhì)結(jié)合的有機(jī)小分子硒化合物，如各種硒代氨基酸可以溶解在水中，其在有機(jī)溶劑甲苯、乙醇和環(huán)己烷中有較高的溶解度，因此水相中的小分子有機(jī)硒可以用有機(jī)溶劑分離。本試驗(yàn)采用對環(huán)境毒性小，安全性高且易揮發(fā)的環(huán)己烷進(jìn)行萃取分離。在最優(yōu)工藝條件下，探討不同萃取次數(shù)對無機(jī)硒測定的影響。4份平行樣品過濾后，把濾液分別置于4個分液漏斗中，加入10 mL環(huán)己烷，振蕩萃取，分別重復(fù)萃取1次、2次、3次和4次。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，萃取次數(shù)越多，水相中無機(jī)硒質(zhì)量比越低，說明有機(jī)硒在環(huán)己烷試劑中有較大的溶解度，萃取2次后，無機(jī)硒含量變化不明顯，因此確定萃取次數(shù)為2次。

圖1 萃取次數(shù)對無機(jī)硒含量的影響

萃取劑環(huán)己烷不同用量對無機(jī)硒測定的影響如圖2所示。4份平行樣品過濾后，將濾液置于4個分液漏斗中，分別加入5 mL、8 mL、10 mL、15 mL環(huán)己烷，震蕩萃取，各萃取2次。由圖2可見，隨著萃取劑用量的增加，濾液中無機(jī)硒含量降低，當(dāng)萃取劑用量為10 mL時，無機(jī)硒含量最低，繼續(xù)增加萃取劑用量，無機(jī)硒含量不再變化。

圖2 萃取劑用量對無機(jī)硒含量的影響

3.氫化物發(fā)生條件的選擇

(1)鹽酸體積分?jǐn)?shù)的選擇。載流中的鹽酸和還原劑反應(yīng)產(chǎn)生氫氣，使儀器產(chǎn)生氫火焰，鹽酸體積分?jǐn)?shù)過低會使與硼氫化鉀的反應(yīng)不完全，不能產(chǎn)生足夠的氫氣和氫化物，過高體積分?jǐn)?shù)的鹽酸會對設(shè)備有腐蝕作用。對 5 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別研究了不同的鹽酸體積分?jǐn)?shù)(2.5%～17%)作為載流對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 鹽酸用量對熒光值的影響

由圖3可見，當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)由0到5%增加時，熒光強(qiáng)度也隨之增加，鹽酸體積分?jǐn)?shù)在5%～15%時，熒光強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定且較高，同時考慮到鹽酸用量過高會對儀器管路造成影響。因此，本試驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸作為載流液。

(2)硼氫化鉀質(zhì)量濃度的選擇。硼氫化鉀作為四價硒的還原劑，將四價硒還原成硒化氫后進(jìn)行原子化，因此，硒的還原程度受硼氫化鉀的濃度影響。本試驗(yàn)采用5 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別研究了5、10、15、20、25、30、35 g/L的KBH4溶液作為還原劑對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 硼氫化鉀質(zhì)量濃度對熒光值的影響

由圖4可知，隨著KBH4溶液質(zhì)量濃度增大，熒光強(qiáng)度也隨之增加，但當(dāng)KBH4溶液的質(zhì)量濃度過高時，熒光強(qiáng)度反而降低，這是因?yàn)闅錃饬刻髲亩♂屛诱魵庠斐傻模虼?，KBH4溶液的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和加標(biāo)回收結(jié)果

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

為了研究硒含量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，以測得的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL時線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=213.5x-35.6。連續(xù)測定11次空白試劑，得到的檢出限(3倍標(biāo)準(zhǔn)差/標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)為0.0072 μg/g。用8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度測定8次，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.38%。

圖5 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.加標(biāo)回收結(jié)果

通過加標(biāo)回收試驗(yàn)探究方法的準(zhǔn)確度。取樣品按照上述微波消解方法測總硒加標(biāo)試驗(yàn)(n=5)。按照圖2中試驗(yàn)過程采用 10 mL萃取劑環(huán)己烷萃取2次測無機(jī)硒加標(biāo)試驗(yàn)(n=5)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 樣品總硒和無機(jī)硒加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

結(jié)果表明，總硒加標(biāo)回收率為98.9%～103.29%，無機(jī)硒加標(biāo)回收率為95.45%～103.22%。有機(jī)硒質(zhì)量比為0.161 μg/g，有機(jī)硒含量達(dá)93%。

三、結(jié)論

(1)通過正交試驗(yàn)，原子熒光的最佳檢測條件為負(fù)高壓300 V、燈電流80 mA、原子化爐高度8 mm、原子化溫度200 ℃、載氣流量400 mL/min、屏蔽氣流速900 mL/min、延時時間1.0 s、讀數(shù)時間10 s。

(2)在最佳檢測條件下，確定環(huán)己烷作為萃取劑，萃取2次，每次10 mL，工作曲線在0～10 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，檢測限0.0072 μg/mL。

(3)本試驗(yàn)建立的測定富硒大米中硒含量的檢測方法，不僅靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且操作簡單、快捷，所有儀器裝置也是常見的實(shí)驗(yàn)室配備，為進(jìn)一步推廣到富硒大米生產(chǎn)廠家及其他富硒食品檢測單位提供了重要路徑。