一株維氏氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及其制備疫苗免疫效力比較

孫承文，江小燕,賴迎迢,2，趙長臣，劉春花，任 燕,2， 鞏 華,2，陳總會，陶家發(fā),2*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；2.農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室 廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科氣單胞菌屬，可引起人、獸及多種水生生物發(fā)病，如人體感染可導致胃腸炎、腹膜炎、敗血癥和外傷感染等疾病[1-3]，可感染魚、蝦、龜?shù)榷喾N水生動物[4-10]，引起多種淡水魚腸炎、腹水及出血等癥狀發(fā)生，造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。長期以來，抗生素治療是針對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程細菌性疾病的主要治療方法，但此方法極易使致病菌產(chǎn)生耐藥性特別是多重耐藥性[11-12]，且水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥物殘留也危及環(huán)境及食品安全。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)許多學者對多種魚類進行維氏氣單胞菌疫苗免疫研究，已取得了很好的預防效果[13-16]。因此推進維氏氣單胞菌疫苗的商品化、產(chǎn)業(yè)化進程，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和水產(chǎn)品安全具有十分重要的意義。然而關(guān)于該菌不同培養(yǎng)基組成對其發(fā)酵工藝及制備滅活疫苗的免疫效力影響的研究鮮見報道。本研究通過測定發(fā)酵菌液活菌數(shù)，采用響應面法設(shè)計優(yōu)化維氏氣單胞菌滅活疫苗發(fā)酵培養(yǎng)基組成及用量，研究培養(yǎng)基碳源、氮源、硫酸鹽、磷酸鹽及其交互作用對發(fā)酵菌液活菌數(shù)的影響，并比較考察優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備的滅活疫苗免疫效力，為建立更高產(chǎn)穩(wěn)定的疫苗發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)CA07，由中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所分離自患細菌性敗血病鯽魚腎臟并鑒定、保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①基礎(chǔ)培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB)：蛋白胨 10.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L。②營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+18.0 g/L瓊脂。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫搖床(ZWY-211B，上海智誠分析儀器制造有限公司)；自動發(fā)酵罐(Cell-BF-7 L，中國齊志生物工程設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(UV1800PC，上海奧析科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 一級種子液制備 將維氏氣單胞菌CA07菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基溶解后，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 24 h，挑取典型菌落接種于含營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，28 ℃，150 r/min震蕩培養(yǎng) 14～16 h，作為一級種子液。

1.2.2 單因素試驗 以營養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進行單因素試驗，其他條件保持不變，比較氮源(細菌學蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏)、碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉)、磷酸鹽(磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀)、硫酸鹽(硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅)對維氏氣單胞菌CA07生長影響，確定最佳氮源、碳源、磷酸鹽、硫酸鹽因子，以及最佳添加量對活菌數(shù)的影響。

1.2.3 響應面試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 結(jié)合單因素試驗結(jié)果，利用響應面Box-Behnken試驗，設(shè)計3因素3水平響應面試驗方案。

1.2.4 優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基驗證試驗及滅活疫苗制備 分別用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制的發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)維氏氣單胞菌CA07，培養(yǎng)結(jié)束后測定維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)，比較優(yōu)化培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基對活菌數(shù)的影響。分別添加甲醛溶液(添加后甲醛溶液終濃度為0.30%)于優(yōu)化培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵的菌液中，37 ℃滅活24 h，制備滅活疫苗后稀釋備用。

1.2.5 不同培養(yǎng)基制備的滅活疫苗免疫效力比較 將制備的滅活疫苗按活菌數(shù)以生理鹽水調(diào)整至滅活前活菌數(shù)約4.0×109cfu/mL。取健康鯽魚(體質(zhì)量12～16 g)90 尾，先在27～29 ℃的水環(huán)境下飼養(yǎng)7 d以上，確認健活后，將魚隨機分為3 組，每組30 尾。免疫組腹腔分別注射滅活菌液0.2 mL/尾，對照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對照組腹腔各注射維氏氣單胞菌CA07菌液進行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組的死魚數(shù)，比較不同發(fā)酵培養(yǎng)基制備的CA07株滅活疫苗免疫效力。按公式計算疫苗的相對免疫保護率(RPS)：RPS(%)=(1-(免疫組死亡率/對照組死亡率))× 100%

1.2.6 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗 配制5 L 優(yōu)化后的培養(yǎng)基于 7 L 發(fā)酵罐中高壓滅菌，待冷卻至 28 ℃ 時，接種5%(體積分數(shù))維氏氣單胞菌CA07菌液于優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量為4 L/min，每隔2 h 取樣測定OD600值，繪制該菌的生長曲線及檢測活菌數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 單因素試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計和差異顯著性分析，響應面試驗數(shù)據(jù)采用 Design Expert 12.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳、氮源對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

以葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時，活菌數(shù)最高為3.30×109cfu/mL，且顯著高于其他碳源組，其次為蔗糖、麥芽糖，以可溶性淀粉為碳源時，菌液活菌數(shù)最低(圖1)。因此，選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基最佳碳源。

圖1 碳源種類對活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of carbon source types oncounts of viable bacteria

以胰蛋白胨為氮源時，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)最高為4.20×109cfu/mL，且顯著高于其他氮源組，以大豆蛋白胨作為單一氮源時，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)次之，而以細菌學蛋白胨、酵母膏做為氮源時，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)最低(圖2)。說明胰蛋白胨作為維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)基氮源效果更好。因此，選擇胰蛋白胨作為維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)基氮源。

圖2 氮源種類對活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of nitrogen source types on counts of viable bacteria

從圖3可以看出，碳氮比對維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)影響很大，碳源比例高活菌數(shù)低，隨著氮源比例升高，活菌數(shù)也逐漸增加，當碳氮比為C∶N=1∶2時，活菌數(shù)最高，為4.57×109cfu/mL，說明氮源的用量在較高濃度區(qū)域時，有利于細菌發(fā)酵活菌數(shù)的增加。

圖3 不同碳氮比對活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of carbon source nitrogen source ratio addition on counts of viable bacteria

2.2 磷酸鹽對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖4可見，培養(yǎng)基中添加等量的磷酸二氫鉀作為培養(yǎng)基磷源時，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)為4.43×109cfu/mL，最高且顯著高于其他組(P<0.05 )，其次為磷酸氫二鈉。因此，選擇磷酸二氫鉀作為培養(yǎng)基磷源。磷酸二氫鉀的添加量在1.5 g/L時，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)最高(圖5)。

圖4 磷酸鹽種類對活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of phosphate types on counts of viable bacteria

圖5 磷酸二氫鉀添加量對活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 on counts of viable bacteria

2.3 硫酸鹽對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖6可見，在培養(yǎng)基中添加等量的硫酸鹽條件下，添加硫酸鎂時，維氏氣單胞菌CA07菌液活菌數(shù)最高為4.59×109cfu/mL，且顯著高于其他組 (P<0.05)，其次為硫酸亞鐵，最低為硫酸錳。因此，選擇硫酸鎂作為培養(yǎng)基無機鹽。硫酸鎂為0.40 g/L時，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)最高(圖7)。

圖6 硫酸鹽種類對活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of sulfate types on counts of viable bacteria

圖7 硫酸鎂添加量對活菌數(shù)的影響Fig.7 Effect of MgSO4 on counts of viable bacteria

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取碳氮比(A)、硫酸鎂(B)和磷酸二氫鉀(C)3個因素進行響應面優(yōu)化設(shè)計(表1)，以活菌數(shù)(Y)為響應值，維氏氣單胞菌活菌數(shù)結(jié)果見表2。

表1 響應面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

表3 響應面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface model

2.4.3 響應面圖分析 各因素交互作用對菌株發(fā)酵活菌數(shù)結(jié)果的影響見圖8。當3個因素其中之一固定為零水平時，其他兩個因素存在交互作用且存在一個活菌數(shù)最大值的組合點。在3組交互影響的圖中，可以看出當其中一個因素固定時，隨著另一因素的增大，維氏氣單胞菌活菌數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

圖8 各因素交互作用對活菌數(shù)影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on counts of viable bacteria

由圖8可以看出，當硫酸鎂用量固定時，活菌數(shù)隨碳氮比及磷酸二氫鉀用量的變化幅度較大，而活菌數(shù)隨著硫酸鎂用量的變化幅度較小，氮碳比、磷酸二氫鉀對發(fā)酵維氏氣單胞菌CA07的影響較為顯著。通過最優(yōu)化分析，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方組成及用量：胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L。

2.5 發(fā)酵活菌數(shù)比較試驗

通過對優(yōu)化后培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基在發(fā)酵維氏氣單胞菌活菌數(shù)的比較，優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為5.94×109cfu/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為4.15×109cfu/mL，活菌數(shù)增加了43.13%，效果顯著(圖9)。

圖9 維氏氣單胞菌兩種培養(yǎng)基的比較Fig.9 Comparison among the two culture mediums of Aeromonas veronii

2.6 免疫效力比較試驗

免疫效力比較結(jié)果見表4，以優(yōu)化培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對免疫保護率為77.78%，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對免疫保護率為62.97%以上，以優(yōu)化培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對免疫保護率提高了14.81%。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成在獲得更高的活菌數(shù)同時，能顯著提高該疫苗的相對免疫保護率。

表4 不同發(fā)酵培養(yǎng)基菌液制備的疫苗免疫效力比較Table 4 Comparison of immune efficacy of vaccines prepared by different fermentation mediums

2.7 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵生長試驗

根據(jù)響應面試驗優(yōu)化結(jié)果，配制含蛋白胨10.8 g/L、牛肉膏3.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫酸鎂0.40 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，300 r/min培養(yǎng)12 h，維氏氣單胞菌生長曲線見圖10。結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)10～12 h進入生長高峰期，發(fā)酵10 h達到生長高峰，活菌數(shù)達到8.85×109cfu/mL，發(fā)酵12 h后進入衰亡期。

圖10 維氏氣單胞菌發(fā)酵生長曲線Fig.10 Growth curve of Aeromonas veronii during the fermentation

3 討 論

本研究以發(fā)酵維氏氣單胞菌菌液活菌數(shù)為目標，通過單因素試驗及響應面試驗進行設(shè)計優(yōu)化，對碳氮比、硫酸鎂、磷酸二氫鉀三個因素進行響應面分析，結(jié)果顯示模型顯著，失擬不顯著，說明這個因素對維氏氣單胞菌菌液活菌數(shù)有顯著影響。建立了一個維氏氣單胞菌活菌數(shù)產(chǎn)量與三個因素的數(shù)學模型，此模型能很好地擬合實驗結(jié)果，其預測條件與驗證實驗基本吻合。得到維氏氣單胞菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，發(fā)酵活菌數(shù)為5.94×109cfu/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為4.15×109cfu/mL，活菌數(shù)增加了43.13%。在此發(fā)酵培養(yǎng)基條件下維氏氣單胞菌在7 L發(fā)酵罐活菌數(shù)達到8.85×109cfu/mL。相較于BHI、TSB等商品化培養(yǎng)基，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基能顯著降低生產(chǎn)成本。

通常對細菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化多采用單因素法、正交試驗法、響應面法。單因素試驗實驗設(shè)計簡單，但忽略了因素之間的交互作用；正交設(shè)計無法確定試驗影響因素的最佳組合和試驗結(jié)果響應值的最大值；響應面優(yōu)化法對整個面進行全面分析，研究因素與響應值之間，因素與因素之間的關(guān)系，并進行優(yōu)化，得到的數(shù)據(jù)更精確、更全面，對試驗有顯著影響的因素都可以應用響應面優(yōu)化法進行優(yōu)化[14]。較多的研究采用響應面法對芽胞桿菌、乳酸桿菌等發(fā)酵培養(yǎng)基組分、用量進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)[15-17]。本研究使用的響應面法即可考察因素之間的交互作用，又可尋找到整個區(qū)域內(nèi)的最優(yōu)解，進一步降低了培養(yǎng)基用量，從而降低成本。通過單因素試驗確定了主要培養(yǎng)基種類及最佳適用量范圍后，再通過響應面分析充分考慮活菌數(shù)與用量之間的交互作用，并通過相應曲面尋找最優(yōu)解。

細菌疫苗免疫效力的提升方法常見的包括改造菌株抗原制備亞單位疫苗、活疫苗、DNA疫苗等，或者通過與佐劑等提呈作用以達到提高免疫效力的目的，具有較好的效果，然而這些方法較為復雜、成本相對較高。本研究通過對細菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成、用量的優(yōu)化最終獲得低成本、高效的疫苗目標。優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗免疫鯽魚的相對免疫保護率為77.78%，相對免疫保護率比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了14.81%，表明優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗具有良好的免疫保護效果。