一種測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草酸含量的酶標(biāo)儀微量反應(yīng)方法

柴林山，李劍梅，孫翠煥，謝存一，張疏雨，朱萬(wàn)芹,白玉紅

(1.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000；2.營(yíng)口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 營(yíng)口 115000)

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)又稱北蟲(chóng)草，屬子囊菌門(Ascomycota)蟲(chóng)草菌科(Cordycipitaceae)蟲(chóng)草屬(Cordyceps)真菌[1]，富含多種天然藥理活性成分并具有多種藥理作用[2-3]。蟲(chóng)草酸是蟲(chóng)草類真菌的主要有效成分，又名D-甘露醇，化學(xué)分子式C7H12O6，為1,3,4,5-四羥基環(huán)己酸，具有利尿、抗氧化、預(yù)防和治療腦血栓、腦出血、心肌梗死等功效，蟲(chóng)草酸含量是蟲(chóng)草產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一[4]。目前，蟲(chóng)草酸的測(cè)定方法有滴定法、旋光法、高效液相色譜法、氣相色譜法、分光光度法等[5-8]。分光光度法是測(cè)定蟲(chóng)草酸的常用方法之一[9-11]，但分光光度法受到比色槽數(shù)量限制，單次測(cè)定數(shù)量少，且操作繁瑣，試劑用量大。酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)在測(cè)定原理上是相同的，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)的吸光度與濃度呈線性關(guān)系，且酶標(biāo)儀可測(cè)定樣品數(shù)量多，一般96個(gè)，測(cè)定速度快，操作簡(jiǎn)單，試劑用量少[12-13]。本研究以酶標(biāo)儀為檢測(cè)儀器，建立酶標(biāo)儀微量法，即在96孔板內(nèi)按照設(shè)定反應(yīng)條件微量加入樣品和試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后利用酶標(biāo)儀測(cè)定蟲(chóng)草酸含量，以期提高蟲(chóng)草酸的檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)樣本的高通量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)子實(shí)體CM1～CM7為遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌實(shí)驗(yàn)室栽培獲得。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 高碘酸鈉、乙酸胺、冰醋酸、L-鼠李糖(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)。分析天平(PR224ZH/E OHAUS)；酶標(biāo)儀(Multiskan GO 1510，Thermo Fisher)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV6000，METASH)；96孔微孔板(Corning 3635，美國(guó)康寧)；恒溫水浴鍋(HH-4，常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草子實(shí)體蟲(chóng)草酸提取液制備 參考鄧?yán)璧萚11]的方法：蛹蟲(chóng)草子實(shí)體于烘箱內(nèi)55 ℃干燥，粉碎，過(guò)80目篩，料液比1∶30(g/mL，W/V)，于90 ℃熱水浸提60 min，離心取上清液，沉淀用蒸餾水洗滌兩次，離心，合并上清液，定容至50 mL，得到蟲(chóng)草酸待測(cè)樣品液。

1.2.2 酶標(biāo)儀測(cè)定蟲(chóng)草酸最佳體積的確定 參考蔣永紅等[12]的方法(以下稱為標(biāo)準(zhǔn)法)，分別吸取1 mL質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L 的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液1 mL至10 mL具塞比色管中，加1 mL 0.05 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應(yīng)10 min；再加2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液，震蕩混勻后加4 mL新配制的Nash試劑53 ℃ 水浴15 min，快速冷卻至室溫。分別取50、100、150、200、250 μL待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液于96孔板中，以相應(yīng)體積的蒸餾水為空白對(duì)照，置于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制甘露醇不同體積系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液驗(yàn)證曲線精確度。

1.2.3 酶標(biāo)儀微量反應(yīng)體系的確定 按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)法，用移液槍向96孔板中分別加入25 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液，再加入25 μL高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應(yīng)10 min，再加50 μL 0.1% 的L-鼠李糖溶液，震蕩混勻后加100 μL新配制的Nash試劑，構(gòu)建200 μL總體積的反應(yīng)體系，用防水自封袋密封后53 ℃水浴15 min使其呈色，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃冰箱預(yù)冷2 min，取防水自封袋，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制微量反應(yīng)體系下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)法和微量法曲線方程進(jìn)行比較。

1.2.4 酶標(biāo)儀微量法水浴時(shí)間的確定 將微量反應(yīng)法中水浴顯色時(shí)間設(shè)定為5、10、12、15、18、20 min，水浴結(jié)束后，4 ℃冰箱預(yù)冷2 min，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，比較不同水浴時(shí)間對(duì)OD值的影響。

1.2.5 酶標(biāo)儀微量法的方法學(xué)考察 ①精密度試驗(yàn)：取樣品CM1和CM2的待測(cè)液，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)6次，酶標(biāo)儀微量法測(cè)定OD值；②重復(fù)性試驗(yàn)：分別取濃度為40 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液(B40)和CM2的蟲(chóng)草酸樣品液各6份，酶標(biāo)儀微量法測(cè)定OD值；③加標(biāo)回收率試驗(yàn)：設(shè)置 6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組加 0.5 mL CM1樣品溶液，然后分別加入0、10、20、30、40、50 mg/L蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各 0.5 mL，充分混勻后，酶標(biāo)儀微量法測(cè)定OD值，計(jì)算回收率。

1.2.6 酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸含量 取蟲(chóng)草酸待測(cè)液用蒸餾水稀釋10倍，酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蟲(chóng)草酸含量，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以1.2.2制備的待測(cè)液采用分光光度計(jì)繪制分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)蟲(chóng)草酸待測(cè)液進(jìn)行蟲(chóng)草酸含量測(cè)定，根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蟲(chóng)草酸含量，并對(duì)酶標(biāo)儀微量法和分光光度法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀測(cè)定蟲(chóng)草酸最佳體積的確定

在標(biāo)準(zhǔn)法反應(yīng)條件下，繪制不同體積甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，不同體積標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值均達(dá)到0.986 1以上，且隨著待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品體積的增加，同一濃度的樣品光密度逐漸增大，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率也逐漸增大。采用已知質(zhì)量濃度為40 mg/L的蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品按照1.2.2標(biāo)準(zhǔn)法制備待測(cè)液，3次重復(fù)。將反應(yīng)待測(cè)液用移液槍分別吸取50、100、150、200、250 μL置于96孔板，在412 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，將OD值分別代入相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度，結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)于蟲(chóng)草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)液，當(dāng)體積為50 μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)誤差均較大，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)液體積為100～150 μL時(shí)，與已知標(biāo)準(zhǔn)樣品值相對(duì)誤差較大，測(cè)定結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)液體積達(dá)到200 μL及以上時(shí)，相對(duì)誤差在1.44%以內(nèi)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)合檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度及操作便捷性，采用測(cè)定體積為200 μL為宜。

表1 酶標(biāo)儀比色法不同體積標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色影響Table 1 The effect of the colorimetric method of the microplate reader on the color development of standard samples of different volumes

圖1 蟲(chóng)草酸系列體積下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Fig.1 Standard curve equation under the volume of cordycepic acid series

2.2 酶標(biāo)儀微量法反應(yīng)體系的確定

在酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)法基礎(chǔ)上，按照標(biāo)準(zhǔn)法操作，在96孔板上以總體積200 μL 檢測(cè)體積為基準(zhǔn)，按照1.2.3方法進(jìn)行酶標(biāo)儀微量法甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，同時(shí)比較標(biāo)準(zhǔn)法相同體積下不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。圖2結(jié)果顯示，微量法與標(biāo)準(zhǔn)法在酶標(biāo)儀下，200 μL 體積下測(cè)定的OD值相當(dāng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為微量法y=0.008 8x+0.046 2(R2=0.998 7)和標(biāo)準(zhǔn)法y=0.008 6x+0.044(R2= 0.996 6)。兩種方法曲線斜率K值基本一致，R2值在0.996 6以上，均具有良好的線性關(guān)系，酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蟲(chóng)草酸具可行性。

圖2 200 μL體積下標(biāo)準(zhǔn)法與微量法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Fig.2 Standard curve equations of standard method and micro method in 200 μL

2.3 水浴反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響

在酶標(biāo)儀微量反應(yīng)過(guò)程中，考察水浴時(shí)間對(duì)OD值的影響，40 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品不同水浴時(shí)間OD值結(jié)果顯示在5～20 min內(nèi)吸光度值呈先升高后下降趨勢(shì)，水浴15 min時(shí)最高，直至18 min內(nèi)趨于平穩(wěn)，20 min時(shí)顯著降低。對(duì)照已知標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度(40 mg/L)與15 min時(shí)實(shí)際測(cè)定樣品質(zhì)量濃度(40.57 mg/L)，因此最佳水浴時(shí)間設(shè)定為15 min(圖3)。

圖3 不同水浴時(shí)間對(duì)OD值的影響Fig.3 The influence of different water bath time on the absorbance OD value

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 精密度試驗(yàn) 采用酶標(biāo)儀微量法測(cè)定樣品CM1和CM2的蟲(chóng)草酸含量，每個(gè)樣品6次重復(fù)，測(cè)得的OD值代入曲線方程，計(jì)算蟲(chóng)草酸含量，從表2中可看出，每個(gè)樣品6次測(cè)定結(jié)果相近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為0.829%和1.772%，說(shuō)明酶標(biāo)儀微量法測(cè)定結(jié)果精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)(n=6)Table 2 Precision test (n=6)

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 采用酶標(biāo)儀微量法測(cè)定40 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品(B40)和樣品CM2中蟲(chóng)草酸含量，每個(gè)樣品6次重復(fù)，測(cè)定的OD值，帶入曲線方程，計(jì)算蟲(chóng)草酸含量，表3顯示標(biāo)準(zhǔn)液B40(40 mg/L)和樣品CM2的測(cè)定結(jié)果，RSD值分別為2.061%和1.599%，表明酶標(biāo)儀微量法測(cè)定結(jié)果具有較好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)Table 3 Repeatability test (n=6)

2.4.3 加標(biāo)回收試驗(yàn) 在CM1樣品中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，微量酶標(biāo)儀法測(cè)定6組樣品OD值，計(jì)算各組的蟲(chóng)草酸含量，進(jìn)一步計(jì)算各組的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。6組樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的平均值為99.24%，RSD值為3.666%，表明酶標(biāo)儀微量法有較高的回收率，且檢測(cè)準(zhǔn)確度較高。

表4 回收率試驗(yàn)(n=6)Table 4 Recovery rate test (n=6)

2.5 酶標(biāo)儀微量法與分光光度法測(cè)定蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸含量的比較

分別采用酶標(biāo)儀微量法和標(biāo)準(zhǔn)法制備CM1～CM7共7個(gè)樣品的蟲(chóng)草酸待測(cè)液，每個(gè)樣品3次重復(fù)，利用酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)對(duì)待測(cè)樣品OD值進(jìn)行測(cè)定，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算蟲(chóng)草酸含量(圖4)。結(jié)果顯示，利用分光光度法和酶標(biāo)儀微量法測(cè)得的相同樣品蟲(chóng)草酸含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。采用Origin 8.6軟件分別對(duì)酶標(biāo)儀微量法和分光光度法測(cè)定的7個(gè)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體樣品蟲(chóng)草酸含量結(jié)果進(jìn)行擬合分析，驗(yàn)證兩種方法的相關(guān)性，相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖5。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上根據(jù)相關(guān)關(guān)系的強(qiáng)弱，將R=7.0看成是一個(gè)中等到較高的相關(guān)[13]，本研究中酶標(biāo)儀微量法和分光光度法測(cè)定結(jié)果相關(guān)性分析的R=0.993 15，說(shuō)明兩種方法具有較高的正相關(guān)性，驗(yàn)證了酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蟲(chóng)草酸的準(zhǔn)確性。

圖4 分光光度法和酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蟲(chóng)草酸含量的比較Fig.4 Comparison of cordycepic acid content by spectrophotometry and micro method

圖5 酶標(biāo)儀微量法與分光光度法測(cè)定蟲(chóng)草酸含量相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of the content of cordycepic acid by micro-reaction method with microplate reader and spectrophotometer method

3 討 論

蟲(chóng)草酸作為蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中主要的藥理活性物質(zhì)之一，其含量的多少是評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草制品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[14-16]，目前蟲(chóng)草酸含量的測(cè)定主要采用高效液相色譜法和分光光度法，雖然高效液相色譜法在測(cè)量準(zhǔn)確性和精確度上具有一定優(yōu)勢(shì)，但其對(duì)儀器設(shè)備、試劑純度及檢測(cè)人員技術(shù)水平要求較高。而分光光度法因其試劑成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)準(zhǔn)確度較高被廣泛接受[17-18]。酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)在測(cè)定原理上是相同的，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)的OD與濃度呈線性關(guān)系，不同在于分光光度計(jì)光路為水平，光程固定，加樣量不一致對(duì)測(cè)量結(jié)果沒(méi)有影響，但測(cè)定時(shí)需樣品量大、速度慢、效率低[14]。酶標(biāo)儀具有96個(gè)比色槽，最多可同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行多波段掃描和測(cè)定，速度快、效率高，96孔板在酶標(biāo)儀上1 min之內(nèi)就可獲得OD數(shù)據(jù)結(jié)果，測(cè)定上百個(gè)樣品只需幾分鐘時(shí)間便可完成[19-21]，因此相較分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀測(cè)定相關(guān)樣品時(shí)具有較大優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于樣品檢測(cè)[22]。因酶標(biāo)儀光路為垂直，加樣量多少直接影響OD值，檢測(cè)體積的大小直接影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，一般體積太小會(huì)造成較大的檢測(cè)誤差[23]，本研究對(duì)酶標(biāo)儀檢測(cè)蟲(chóng)草酸含量的檢測(cè)體積進(jìn)行了分析，確定了當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)液體積達(dá)到200 μL及以上時(shí)，相對(duì)誤差在1.44%以內(nèi)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，以檢測(cè)體積為200 μL為最優(yōu)。在此基礎(chǔ)上探討了以96孔板為反應(yīng)載體的微量樣品和試劑添加的反應(yīng)方法，在200 μL反應(yīng)體系下，酶標(biāo)儀微量法與標(biāo)準(zhǔn)方法的OD值和曲線斜率無(wú)差異，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有高度一致性，驗(yàn)證了酶標(biāo)儀微量法具較高準(zhǔn)確度。為分析酶標(biāo)儀微量法中水溶時(shí)間對(duì)OD值的影響，本研究對(duì)酶標(biāo)儀微量法中不同水浴時(shí)間影響進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示水浴時(shí)間與OD值具相關(guān)性，呈先升高再降低的趨勢(shì)，水浴時(shí)間在15 min時(shí)，OD值最大，結(jié)果可知反應(yīng)體系的體積大小對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系無(wú)明顯影響，確定水浴最佳時(shí)間為15 min。本研究對(duì)酶標(biāo)儀微量法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等進(jìn)行了方法學(xué)考察，精密度試驗(yàn)中樣品CM1的RSD值0.829%，樣品CM2的RSD值1.772%顯示較高的精密度；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品的RSD值2.061%，樣品CM2 的RSD值1.599%，重復(fù)性良好、樣品平均回收率99.24%，回收率評(píng)價(jià)RSD值3.666%，回收率較高，本方法檢測(cè)準(zhǔn)確性高。為驗(yàn)證該方法測(cè)定蟲(chóng)草酸的準(zhǔn)確性，將其測(cè)定結(jié)果與分光光度法進(jìn)行了比較及兩種方法的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)，同時(shí)兩種方法具有較強(qiáng)的相關(guān)性(R=0.993 15)。

本研究利用酶標(biāo)儀為檢測(cè)儀器，在驗(yàn)證酶標(biāo)儀檢測(cè)蟲(chóng)草酸含量準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)上，建立酶標(biāo)儀微量法測(cè)定蟲(chóng)草酸含量的方法，即以96孔板為反應(yīng)載體，通過(guò)微量樣品和試劑在96孔板內(nèi)實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)進(jìn)而測(cè)定蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草酸含量的方法。具體反應(yīng)條件：移液槍取樣品溶液25 μL于96孔板內(nèi)，加入25 μL高碘酸鈉溶液，混勻，室溫反應(yīng)10 min，加入50 μL L-鼠李糖溶液，加100 μL新配制的Nash試劑，96孔板封膜防水后，于53 ℃ 水浴15 min，迅速放入4 ℃冰箱預(yù)冷2 min，去掉防水膜后，于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定OD值，并根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)蟲(chóng)草酸含量。此方法具有較高的精密度、重復(fù)性、回收率，表明酶標(biāo)儀微量法可以替代分光光度法，用于蟲(chóng)草酸含量的測(cè)定，此法可大大減少樣品試劑的用量，且反應(yīng)和檢測(cè)在96孔板內(nèi)完成，方便、快捷、高效。