柴達(dá)木沙漠鏈霉菌S10T阿糖腺苷的大孔樹脂分離工藝優(yōu)化與結(jié)構(gòu)鑒定

吳玉潔,姜 侃,張 威,于 雪,4,汶 瑛,4,劉光琇,陳 拓

(1.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 冰凍圈科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049；5.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

天然產(chǎn)物(Natural products)作為如今非常重要的化合物家族，由于其普遍具有生物活性而被廣泛研究[1]，尤其是一些具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒活性的化合物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程。其中有超過8萬(wàn)種活性天然產(chǎn)物是由鏈霉菌產(chǎn)生的[2-4]。由鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素主要有非核糖體肽(NRPs)、聚酮類(PKS)、NRPS-PKS雜合化合物、氨基糖苷類(aminoglycoside)、氨基香豆素(aminocoumarin)、?；鶅?nèi)酯(acyl-lactone)、醌類化合物(quinone)、磷酸糖脂(phosphglydolipied)和核苷類化合物(nucleoside)。其中核苷類抗生素(nucleoside antibiotics)是由核苷或核酸衍生而來(lái)的一類抗生素，目前所發(fā)現(xiàn)的核苷類抗生素幾乎全部來(lái)源于微生物[5]。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有相似性——核苷基團(tuán)，而其他基團(tuán)結(jié)構(gòu)則非常多樣，這就使得核苷類抗生素能夠參與多種細(xì)胞基礎(chǔ)代謝過程。因此核苷類抗生素具有非常廣泛的生物學(xué)活性。根據(jù)其生物學(xué)活性可分為抗細(xì)菌活性、抗真菌活性和抗病毒活性三大類[6]。由于核苷類抗生素廣譜的生物學(xué)活性、復(fù)雜多變的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制，使得核苷類抗生素的研究受到了廣泛關(guān)注，所以對(duì)于核苷類抗生素及其生物合成的研究是非常重要的。本研究所采用的柴達(dá)木沙漠鏈霉菌(Streptomycesqaidamensis)S10T是一株分離自柴達(dá)木盆地的鏈霉菌新種。甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)菌株S10T的發(fā)酵液粗提物對(duì)于抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)具有抑菌活性[7]，并且對(duì)革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性菌和真菌具有廣譜的抗菌活性，因此開展菌株S10T產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。本研究利用大孔吸附樹脂從菌株S10T中提取活性天然產(chǎn)物，篩選了具有良好吸附及解吸性能的大孔吸附樹脂，對(duì)粗提物進(jìn)行了初步分離，并鑒定了分離得到的化合物結(jié)構(gòu)。大孔吸附樹脂由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積使得其兼具吸附性和分子排阻效應(yīng)，通過選擇不同極性和不同孔徑的樹脂即可達(dá)到分離純化的目的，具有更強(qiáng)的分離特異性[8]。且大孔吸附樹脂具有吸附速度快，不受無(wú)機(jī)鹽和強(qiáng)離子等影響，因此廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離[9]。通過對(duì)菌株S10T中活性天然產(chǎn)物分離方法的探究，為進(jìn)一步開發(fā)該菌株產(chǎn)生的多種具有新穎結(jié)構(gòu)或活性的化合物，為利用大孔吸附樹脂從鏈霉菌中發(fā)掘活性天然產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 抑菌測(cè)定指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，以上供試菌由甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)菌株柴達(dá)木沙漠鏈霉菌(Streptomycesqaidamensis) S10T，由甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基；②MS培養(yǎng)基：黃豆粉 20 g，加入自來(lái)水800 mL，煮沸2 h后過濾得濾液，加入甘露醇 20 g，瓊脂 20 g，加自來(lái)水至1 000 mL；③ISP-2培養(yǎng)基；④高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 無(wú)水乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；色譜級(jí)甲醇和乙腈均購(gòu)自邁瑞達(dá)科技有限公司；氘代試劑購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室(CIL)；大孔吸附樹脂XAD-7HP、XAD-16、AB-8和HP-20，反向硅膠填料購(gòu)自北京慧德易科技有限責(zé)任公司；卡那霉素、TTC(氯化三苯四氮唑)購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；葡聚糖凝膠LH-20購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司)；Heal Force臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(23R，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；高效液相色譜儀(EClassical 3100，大連依利特分析儀器有限公司)；超高分辨率質(zhì)譜儀(TSQ Alitis，賽默飛世爾科技有限公司)；400 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE NEO，布魯克科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn) ①活性物質(zhì)濃縮：菌株S10T使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基經(jīng)過7 d發(fā)酵后所得的菌液離心除去菌絲體后所得上清即為發(fā)酵液，發(fā)酵液使用等體積乙酸乙酯萃取后重新溶解，濃縮至活性物質(zhì)濃度為10 mg/mL，該濃縮發(fā)酵液供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。②樹脂篩選實(shí)驗(yàn)：在4個(gè)500 mL三角瓶中分別加入10 g預(yù)處理好的XAD-7HP、XAD-16、AB-8和HP-20樹脂[10]，加入100 mL濃縮發(fā)酵液，靜態(tài)吸附0.5 h后，取出吸附后剩余濃縮發(fā)酵液進(jìn)行抗菌物質(zhì)濃度測(cè)定。③不同pH值對(duì)吸附能力的影響：分別稱取5 g處理好的AB-8濕樹脂5份于5個(gè)500 mL三角瓶中，量取100 mL濃縮發(fā)酵液，分別將pH調(diào)為1、3、6、9、12，吸附2 h后，取吸附后剩余濃縮發(fā)酵液進(jìn)行活性物質(zhì)含量的測(cè)定，并計(jì)算吸附效率。④AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附量測(cè)定：分別稱取2 g處理好的AB-8濕樹脂于500 mL三角瓶中，再加入100 mL濃縮發(fā)酵液，分別吸附0.5、1、2、4、6、8、12、24 h，取出吸附后剩余濃縮發(fā)酵液測(cè)定其殘余活性物質(zhì)含量。⑤洗脫液濃度選擇：分別稱取5 g處理好的AB-8濕樹脂于12個(gè)500 mL三角瓶中，加入100 mL發(fā)酵液，吸附2 h后，濾紙過濾除去吸附后的剩余濃縮發(fā)酵液，分別測(cè)定其中抗菌活性物質(zhì)含量。過濾后濕樹脂分別用0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇洗脫，分別測(cè)定洗脫液中活性物質(zhì)含量。

1.2.2 活性天然產(chǎn)物分離及鑒定 ①天然產(chǎn)物分離：使用200目正向硅膠分離洗脫液，再分別使用石油醚與乙酸乙酯、氯仿與甲醇不同比例梯度洗脫，合并相同組分。打孔法[11]對(duì)分離得到的組分進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，對(duì)于有抑菌活性的組分再以不同比例的甲醇與水為洗脫液反相硅膠進(jìn)行分離。最后將進(jìn)一步分離得到的活性物質(zhì)組分經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20分離，分別使用100%、70%、30%的甲醇和純水作為洗脫劑，梯度洗脫，TLC分析后將相同的組分合并。②結(jié)構(gòu)鑒定：將分離提純的化合物用氘代DMSO溶解后，核磁共振儀測(cè)定其1H和13C同位素峰。甲醇溶解的化合物使用高分辨質(zhì)譜測(cè)定其質(zhì)核比及相對(duì)分子質(zhì)量。③色譜條件：色譜柱為ODS-18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V乙腈∶V1‰TFA水溶液=75∶25，等梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 抑菌活性檢測(cè)方法 發(fā)酵液及化合物抑菌活性的檢測(cè)使用氯化三苯四氮唑(TTC)顯色法[12]。精確稱取TTC 1 g，用100 mL蒸餾水溶解，配制成1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶液，0.22 μm的無(wú)菌濾器過濾除菌后避光保存?zhèn)溆?。檢測(cè)抑菌活性時(shí)再將1% TTC溶液使用培養(yǎng)基稀釋100倍加入96孔板中，同時(shí)加入樣品和供試菌液(TTC、樣品和供試菌液的量可根據(jù)不同菌株進(jìn)行調(diào)整，但總量保持在200 μL)。TTC作為細(xì)菌呼吸的氫受體加入培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)菌在脫氫酶的作用下，無(wú)色的TTC生成不溶于水的紅色三苯甲腙。根據(jù)顏色變化能夠準(zhǔn)確且直觀地判斷細(xì)菌是否生長(zhǎng)。

1.2.4 計(jì)算方法 樹脂吸附量Q(mg/g)、吸附效率q(mg/(g·h))按下列公式計(jì)算：Q(mg/g)=(ρ0ν0-ρ1ν1)/m，q(mg/(g·h))=Q/Δt。式中：ρ0ν0為濃縮發(fā)酵液質(zhì)量濃度(mg/mL)和體積(mL)；ρ1ν1為吸附后剩余濃縮發(fā)酵液質(zhì)量濃度(mg/mL)和體積(mL)；m為處理好的濕樹脂質(zhì)量(g)；Δt為吸附時(shí)間(h)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)分析

2.1.1 樹脂篩選 樹脂篩選試驗(yàn)中，當(dāng)吸附時(shí)間相同(0.5 h)時(shí)，AB-8樹脂的吸附效率高于其他樹脂(圖1A)，對(duì)比四種大孔吸附樹脂的性能(表1)發(fā)現(xiàn)，這可能是由于AB-8樹脂相對(duì)XAD-16和HP20，屬于弱極性樹脂[14]，在吸附過程中不僅能夠吸附帶有極性基團(tuán)的非極性化合物也能夠吸附極性化合物。而與極性相似的XAD-7HP相比，AB-8則具有更大的比表面積和更小的孔徑，使得在單位時(shí)間內(nèi)AB-8樹脂的吸附量更大，所以后續(xù)試驗(yàn)選擇使用AB-8樹脂作為試驗(yàn)樹脂。

表1 四種大孔吸附樹脂性能比較Table 1 General properties of four microporous resins

2.1.2 不同pH對(duì)AB-8樹脂吸附效率的影響 AB-8樹脂在不同pH條件下對(duì)菌株S10T濃縮發(fā)酵液的吸附效率影響試驗(yàn)表明，濃縮發(fā)酵液的不同pH值對(duì)于樹脂吸附效率的影響并沒有明顯差異。但pH值為9時(shí)，吸附效率最高，說(shuō)明AB-8適宜在弱堿性條件下對(duì)菌株S10T濃縮發(fā)酵液中的活性產(chǎn)物進(jìn)行吸附。因此在后續(xù)化合物提取試驗(yàn)中，需將發(fā)酵液的pH值調(diào)為9(圖1B)。

2.1.3 AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附量 AB-8樹脂飽和吸附量的測(cè)定結(jié)果見表2。測(cè)定結(jié)果表明，AB-8樹脂吸附菌株S10T濃縮發(fā)酵液4 h后，剩余濃縮發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的含量基本達(dá)到平衡狀態(tài)，表明4 h后大孔吸附樹脂的吸附能力已經(jīng)飽和，樹脂的吸附量為138 mg/g。AB-8對(duì)菌株S10T濃縮發(fā)酵液的靜態(tài)飽和吸附動(dòng)力曲線及吸附效率曲線見圖1C。

表2 AB-8靜態(tài)飽和吸附試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of the AB-8 static saturation adsorption

2.1.4 最佳甲醇洗脫濃度試驗(yàn) 設(shè)置0～100%11個(gè)梯度，使用30%～100%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的甲醇洗脫均有較好的洗脫效果(圖1D)，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明0～10%的洗脫液不具有抑菌活性。在后續(xù)分離試驗(yàn)中，可用10%的甲醇洗脫雜質(zhì)，70%的甲醇作為洗脫液濃縮抗菌活性物質(zhì)用于后期分離。

圖1 大孔吸附樹脂對(duì)發(fā)酵液靜態(tài)吸附結(jié)果Fig.1 Results of static adsorption of fermentation broth by macroporous adsorption resinA：大孔樹脂篩選結(jié)果；B：不同pH對(duì)AB-8樹脂吸附效率的影響；C：AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附動(dòng)力學(xué)及吸附效率曲線；D：不同比例甲醇洗脫試驗(yàn)結(jié)果A:Screening results of macroporous resin;B:The effect of different pH on the adsorption efficiency of AB-8;C:AB-8 resin static saturated adsorption kinetics curve;D:Different ratio of methanol elution results

2.2 活性化合物分離

2.2.1 活性化合物分離結(jié)果 初步使用200目正向硅膠，共分離得到了20個(gè)流份，分別為Fr.1～Fr.20。采用5種測(cè)活菌株金黃色萄葡球菌(Staphylococcusaureus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大腸埃希菌(Escherichiacoli)檢測(cè)了Fr.1～Fr.20的抑菌活性，其中除Fr.8、Fr.12和Fr.19外，其他流份都具有抑菌活性(圖2)。使用反相硅膠和葡聚糖凝膠對(duì)Fr.13和Fr.14進(jìn)行下一步分離得到一個(gè)純的化合物，該化合物為白色粉末狀固體，易溶于甲醇和DMSO等有機(jī)溶劑。HPLC檢測(cè)該化合物保留時(shí)間為2.86 min(圖3A)，具有較高的純度，峰面積占比為93.12%。

圖2 Fr.1～Fr.20抑菌活性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Fr.1-Fr.20 antibacterial activity test results圖中深灰色為無(wú)抑菌活性，淺灰色為有抑菌活性；MeOH為甲醇，作為陰性對(duì)照；KM為卡那霉素(質(zhì)量濃度10 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照Dark gray indicates no antibacterial activity；and light gray indicates antibacterial activity；MeOH was methanol,used as a negative control；and KM was kanamycin used as positive control with concentration 10 mg/mL

2.2.2 活性化合物結(jié)構(gòu)鑒定 使用LC-HR-MS對(duì)該化合物的分子量進(jìn)行了表征，該化合物質(zhì)核比為268.103 0(圖3B)，計(jì)算質(zhì)核比為268.104 6，其誤差值為5.97×10-6。結(jié)合1H-NMR和13C-NMR，得到了該化合物的結(jié)構(gòu)(圖3C)，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)該化合物為阿糖腺苷(9-beta-D-Arabinofuranosyladenine,Ara-a,Vidarabine)，是第一個(gè)得到美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證的核苷類抗生素。1H-NMR和13C-NMR結(jié)果如下：1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.35 (s,1H),8.14 (s,1H),7.42 (s,2H),5.83 (s,1H),5.40 (s,2H),5.19 (s,1H),4.59 (s,1H),4.14 (s,1H),3.98 (s,1H),3.67 (s,1H),3.56 (s,1H),3.27 (s,14H),2.52 (s,4H)。13C-NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ156.64,152.85,149.54,140.38,119.83。

圖3 阿糖腺苷質(zhì)核比及結(jié)構(gòu)Fig.3 The m/z and structure of vidarabineA：阿糖腺苷HPLC圖譜；B：阿糖腺苷質(zhì)核比；C：阿糖腺苷結(jié)構(gòu)A：The HPLC spectrum of vidarabine;B:The m/z of vidarabine,C:The structure of vidarabine

3 討 論

本研究采用大孔樹脂吸附、正向硅膠、反相硅膠和葡聚糖凝膠逐步分離的方法，從柴達(dá)木沙漠鏈霉菌S10T中分離得到了阿糖腺苷。目前核苷類抗生素仍然依靠化學(xué)合成方法，在立體異構(gòu)的化合物合成時(shí)通常需要較為苛刻的反應(yīng)條件，如需要重金屬試劑參與反應(yīng)或需要較高的反應(yīng)能量[15]，存在選擇性差、中間產(chǎn)物多和流程復(fù)雜等局限性[16-18]，因此從鏈霉菌中直接分離的方法對(duì)于發(fā)現(xiàn)核苷類抗生素仍然是必要的。

阿糖腺苷是一種核苷類抗生素，具有抑制多種病毒DNA聚合酶的活性，是一種有效的抗病毒藥物。阿糖腺苷首次發(fā)現(xiàn)于海綿中[19]，隨后Satoshi Omura等在鏈霉菌中也分離得到了阿糖腺苷，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)刺膽草、馬地丁和藜麥具有較強(qiáng)的除草活性[20]。除此之外，阿糖腺苷最主要的生物活性為抗病毒活性，它能夠轉(zhuǎn)化為腺嘌呤三磷酸腺苷來(lái)抑制病毒DNA聚合酶。據(jù)Kamiyama等[21]報(bào)道，阿糖腺苷具有抑制阿昔洛韋抗性HSV(單純皰疹病毒)和VZV(水痘帶狀皰疹病毒)的活性。但是阿糖腺苷的抑菌活性未見報(bào)道，本研究也對(duì)該化合物進(jìn)行了抑菌活性檢測(cè)，幾種測(cè)試菌測(cè)活結(jié)果顯示，該化合物并不具有抑菌活性。

Suhadolnik等[22]對(duì)阿糖腺苷在Streptomycesantibioticus中的生物合成進(jìn)行了闡述。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)在S.antibioticus中，阿糖腺苷與另一種治療血液腫瘤的藥物噴司他丁(pentostatin)由同一個(gè)生物合成基因簇負(fù)責(zé)合成。在菌株S10T中，通過對(duì)基因簇中的各個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些基因并非成簇存在，且PenF與菌株S10T中的蛋白序列不存在相似性(表3)，因此在菌株S10T中可能存在與S.antibioticus不同的生物合成途徑。

表3 S. antibioticus中阿糖腺苷合成相關(guān)基因與菌株S10T中相關(guān)基因相似性對(duì)比Table 3 The relactive biosysthesis gene of Ara-A analyze between S.antibioticus and S10T

目前對(duì)于阿糖腺苷生物合成的研究報(bào)道僅S.antibioticus一株鏈霉菌，未見其他生物合成途徑的報(bào)道。本研究同時(shí)還分析了菌株S10T的次級(jí)代謝產(chǎn)物L(fēng)C-HR-MS譜，從中并未找到噴司他丁的相對(duì)分子質(zhì)量，這說(shuō)明菌株S10T僅能合成阿糖腺苷而不合成噴司他丁。因此可以證實(shí)菌株S10T中確實(shí)存在著與報(bào)道完全不同的阿糖腺苷合成途徑。

本研究從柴達(dá)木沙漠鏈霉菌S10T分離的化合物組分中發(fā)現(xiàn)，除阿糖腺苷外，其他組分對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌均具有抑菌活性，與陽(yáng)性對(duì)照卡那霉素相比具有更高的抑菌效價(jià)。這也說(shuō)明柴達(dá)木沙漠鏈霉菌S10T具有非常強(qiáng)大的抑菌活性產(chǎn)物合成能力，相關(guān)的生物活性還有待挖掘，以期能夠發(fā)現(xiàn)更多的活性天然產(chǎn)物。